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CRISPR基因编辑研究秘辛大起底
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CRISPR-Cas9 是在细菌的自然免疫系统基础上发展出来的一个简单高效的基因编辑技术。目前市面上甚至出现了800人民币 的 DIY 工具盒。相关原理之前我在《CRISPR 基因编辑技术及张锋的贡献》及《CRISPR技术的显然性分析 》做了相当详细的介绍。这里我再简略的重复一下。CRISPR-Cas9 系统需要三个组件。一个是 crRNA，它的作用是用于 DNA 切点的定位。二是Cas9 蛋白，这个蛋白的作用是根据 crRNA 指定的目标位置切断DNA。三是 tracrRNA，它的作用是与 crRNA 耦合，并启动 Cas9 。具体来说，crRNA 与 tracrRNA 通过氢键配对之后成为一个耦合体，Cas9 蛋白装入 crRNA +tracrRNA 之后，发生空间结构及属性的变化而具备编辑功能。
CRISPR 研究的重大突破是 2011年法国女科学家 Emmanuelle Charpentier 在《自然》上的论文。她的小组通过基因分析与相关实验，发现除了 Csn1 蛋白（后来称为 Cas9）与 crRNA外，还有 tracrRNA。但这篇论文并没有确定 tracrRNA 的具体作用。随后，美国加州大学的 Doudna 与 Charpentier 隔洋合作，在2012年6月发表了一篇论文，利用 Cas9 与 crRNA + tracrRNA 系统在细胞外的试管实验中实现了DNA 编辑。但 Doudna 在试图把这个系统运用于动植物等真核细胞的编辑中遇到了困难。2013年1月，美国东部 Broad 研究院的张锋发表论文，成功地把 CRISPR-Cas9 运用于真核细胞（人类）的基因编辑。
张锋实验室有个轮替生林帅亮给 Doudna 写过一封投名状，内称张锋和丛乐是在2012年看到 Doudna 的论文之后，才开始 CRISPR的研究。由于林本来是张锋实验室的成员，知道内幕，其所说的一度似乎具有相当的可信度。
我在前文中指出，张锋的真核编辑技术并不是依赖于 Doudna 等人2012年的论文，而主要是基于 Charpentier 2011年发现的 tracrRNA。张2012年1月12日的NIH项目申请（后获得NIH 2012年的两百多万美元的资助（NIH grant R01-DK097768-01））包含了下图的真核编辑设计：
张2013年论文中实验成功的设计与上图（2012年1月的经费申请）相比，主要差别只是是在论文中 Ｃas9 两端（而不是只一端）都装上了 NLS，以更好地让这个蛋白进入真核细胞的细胞核。另外根据张实验室博士生丛乐的实验记录，他们在2012年 Doudna 论文发表之前就已经运用 CRISPR-Cas9 成功进行了真核细胞的基因编辑。
从张2012年一月的NIH申请看，林的说法已经不成立。张至少在 Doudna 论文前5个月就有后来被证明可行的设计。至此，我们仍然不能排除林帅亮对张研究小组的其他项目不知情并且高看了自己的可能。但Broad研究院在前些天公布的林帅亮与张锋的邮件使我们更加清楚了相关事实。
2011年10月23日的邮件中，林帅亮问张锋是否可以将 Cas9 与 crRNA 转染到人类细胞看看（“Do you think we can try to transfect crRNA and Csnl to HEK293 cells to see whether it works? What about your opinion?”）。张锋的回答是："You might have to set up some kind of in vitro transcription system to get the RNA since the tracrRNA and CRISPR array are fairly long for oligo synthesis. I don't think transfecting crRNA alone will work. It is loaded onto Csn-1 as duplex with the tracrRNA. You should read the tracrRNA Nature paper again." (加黑部分：【我认为只转 crRNA 不行。crRNA 是跟 tracrRNA 作为双体被装到 Cas9 上。你应该再读读《自然》上那篇 tracrRNA 论文】)。张的邮件末尾还让林去找丛乐寻求帮助。
从2012年1月11日张锋与林帅亮的邮件通讯中可以清楚地看出，他们正在用人类码表优化了的 SpCas9 （邮件中的 Csn1）, tracrRNA 以及 crRNA 进行 DNA 编辑实验。
值得注意的是，在张给林的指导性邮件中没有提到 Charpentier 论文中提到的另一个组件 - RNase III，只提到了 Cas9, crRNA 与 tracrRNA。这似乎表明，张在写这些ＥＭＡＩＬ时已经知道或者判断出 RNase III 是不必要的。张２０１３年论文的第一组实验就是剔除了ＲNase III.
https://blog.sciencenet.cn/blog-684007-1006482.html
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