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[转载]2月3日植物updates:小麦基因组编辑;稻瘟菌效应蛋白靶标K;...

已有 401 次阅读 2018-2-4 10:18 |个人分类:基因编辑|系统分类:科研笔记|文章来源:转载

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1稻瘟菌效应蛋白靶标水稻钾离子通道

   近日,中国农业科学院植物保护研究所王国梁研究员团队与中国农业大学王毅教授团队合作在PloS Pathogens发表了题为"The fungal pathogen Magnaporthe oryzae suppresses innate immunity by modulating a host potassium channel"的研究论文.该研究发现,稻瘟菌通过效应蛋白AvrPiz-t特异性靶标水稻钾离子通道蛋白OsAKT1促进侵染,揭示了稻瘟菌侵染的新机制.



   由稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)侵染引起的稻瘟病俗称水稻"癌症",往往造成水稻严重减产.深入研究水稻-稻瘟菌互作机制,对提出新的病害防控策略和培育抗稻瘟病的水稻新品种具有重要意义.王国梁研究团队前期研究结果表明稻瘟菌效应蛋白AvrPiz-t通过靶标转录因子APIP5、泛素连接酶APIP6和APIP10抑制水稻的免疫反应(The Plant Cell, 2012;PLoS Pathogens, 2016;Current Biology, 2016).然而,AvrPiz-t是否调控水稻的营养平衡促进稻瘟菌侵染还不清楚.

   钾是植物生长发育所必需的三大营养元素之一.作物生产中增施钾肥能显著提高产量和改善品质,往往还能提高对病原菌的抗病性,然而其分子机制还不清楚.中国农业大学王毅研究团队前期工作中鉴定了水稻中的Shaker钾离子通道蛋白OsAKT1.OsAKT1在水稻钾吸收过程中发挥着重要作用,并影响水稻的产量性状(The Plant Cell, 2014).

   该研究表明,稻瘟菌的效应蛋白AvrPiz-t可以特异性地靶标水稻OsAKT1蛋白,并抑制OsAKT1介导的内向钾电流活性.钾含量和抗病性检测结果显示,对稻瘟菌侵染更为敏感的AvrPiz-t转基因水稻植株钾离子吸收能力受到显著抑制,而对低钾敏感的OsAKT1突变体植株对稻瘟菌侵染更加感病,说明稻瘟菌试图干扰水稻的钾吸收过程,而OsAKT1是水稻钾吸收和抗病性的关键正调控因子.进一步研究发现,AvrPiz-t可以与OsAKT1上游调节因子蛋白激酶OsCIPK23竞争性结合OsAKT1,进而影响OsAKT1的正常激活.与OsAKT1的突变体类似,OsCIPK23的突变体也对稻瘟菌侵染更加敏感.另外,通过水培实验证明,高钾条件下水稻的生物量和对稻瘟菌的抗病性都显著提高.该研究率先发现病原菌效应蛋白通过靶标寄主钾离子通道蛋白干扰寄主钾吸收过程,进而促进病原菌侵染.揭示了植物营养和抗病性之间的内在联系,也为生产上施钾肥增强抗病性提供了分子基础.



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2植物DNA甲基化最新研究成果

   DNA甲基化(DNA methylation)是最早发现的修饰途径之一,是一种重要的表观遗传标记.研究表明,DNA甲基化在调控基因表达、维持染色质结构、基因印记以及胚胎发育等生物学过程中发挥着重大的作用.在植物中,RNA介导的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation, RdDM)是一种重要的甲基化途径.在该途径中,小分子RNA(small interfering RNAs, siRNAs)与ARGONAUTE4(AGO4)蛋白结合形成效应复合体.AGO4/siRNAs复合体与RNA聚合酶V(Pol V)产生的非编码RNA互补从而进一步招募DNA甲基转移酶DRM2( DOMAINS REARRANGED METHYLTRANSFERASE 2, DRM2)等组分,识别特异同源DNA序列并介导甲基化修饰.然而,由于RNA聚合酶V产生的非编码RNA量相对较低,难以用全基因组手段检测;同时,这些非编码RNA是如何介导RdDM也需进一步研究.

   近日,美国加州大学洛杉矶分校美国科学院院士Steven Jacobsen团队在Nature Plants杂志在线发表了题为"RNA-directed DNA methylation involves co-transcriptional small-RNA-guided slicing of polymerase V transcripts in Arabidopsis"的研究论文.该研究利用经过优化的GRO-seq(Global Run-On Sequencing)技术在全基因组范围绘制了参与转录的RNA聚合酶V的位点以及RNA聚合酶V产生的非编码RNA的特性.


   该研究发现,在AGO4/siRNAs复合体与RNA聚合酶V(Pol V)产生的非编码RNA互补后,AGO4会在siRNA第10位对Pol V产生的非编码RNA进行剪切.同时,对RNA聚合酶V产生的非编码RNA的剪切在siRNAs以及 ago4/6/9突变体中消失,说明此过程受siRNAs以及AGO4/6/9共同调控.对于其他RdDM相关突变体的GRO-seq检测表明,SPT5L/KTF1也直接参与调控此过程.该研究揭示了RNA聚合酶V产生的非编码RNA剪切在RNA介导的基因沉默中的重要作用,为研究RNA介导的DNA甲基化提供的新的角度.

   Proposed model for slicing of Pol V transcripts据悉,美国加州大学洛杉矶分校博士研究生刘琬璐与美国加州大学圣地亚哥分校Sascha H. Duttke博士为该论文的共同第一作者. Steven Jacobsen为本文的通讯作者.



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3Nature Protocol|六倍体小麦基因组编辑系统


2014年9月,中科院遗传所高彩霞团队在《Nature Protocols》杂志上发表了题为“Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system”的文章,详细描述了利用CRISPR/Cas系统实现水稻和小麦基因组编辑的实验方案。

如今2018年2月1日高彩霞团队在《Nature Protocols》杂志又发表了题为“Genome editing of bread wheat using biolistic delivery of CRISPR/Cas9 in vitro transcripts or ribonucleoproteins”的文章,作为小麦基因组编辑的升级版本,可以说将小麦基因组编辑技术进一步向前推进。



文献摘要

近年来,CRISPR / Cas9已经成为改善作物性状的有力工具。常规的植物基因组编辑主要依靠通过农杆菌或粒子轰击让质粒携带进行传递后实现编辑。通过粒子轰击传递CRISPR / Cas9的体外转录物(IVT)或核糖核蛋白复合物(RNPs)实现面包小麦的DNA-free的编辑系统。该方法是之前发表的通过粒子轰击传递CRISPR / Cas9质粒的小麦基因组编辑方法的延伸。新的描述的方法不仅消除CRISPR / Cas9随机整合到基因组DNA中,而且减少了脱靶效应。在这个新的方法中,提供了IVT和RNP的准备的详细实验操作步骤,并通过PCR /限制性内切酶(RE)和下一代测序验证;通过使用新的方法,可以在9-11周内获得和鉴定不使用任何外来DNA编辑的植物。

CRISPR/Cas9 IVT-或RNP介导的小麦基因组编辑的概述


整个实验流程包括了CRISPR / Cas9 IVT和RNP的制备,包衣,传递,幼苗再生和突变体筛选。首先在原生质体瞬时转化系统中测定和评估高活性的候选的sgRNA,然后使用sgRNA序列上游T7启动子(步骤1-13)对PCR产物进行转录。使用经过密码子优化的、侧翼有两个NLS序列、玉米泛素1基因的5'-和3'-非翻译区序列及PolyA信号序列的XbaI-linearized pLZT7-zCas9转录Cas9 mRNA(步骤14A)。细菌细胞诱导,表达和纯化Cas9蛋白质(步骤14B)。预组装的RNP复合物通过体外切割(步骤15-19)和原生质体瞬时表达分析(步骤20-30)进行验证。获得未成熟的胚芽的植物在温室中需要生长90天,应该提前启动培养(步骤31)。然后将CRISPR / Cas9 IVT或RNP传递到收获的未成熟胚芽中(步骤32-37),并通过NGS确认传递(步骤38-46;图2)。在整个组织培养过程中不使用抗生素。2周后诱导产生胚性愈伤组织(步骤47),4-6周后完成再生(步骤48-50)。首先通过PCR / RE利用保守的引物同时识别库中三种不同类型的突变体幼苗(步骤51-57)。蓝色的表示代表性的突变体。给出阳性信号的幼苗通过PCR / RE和用homolog-specific primer 扩增后测序(步骤58-61)。 NHEJ引入的突变可导致未分离的条带,以蓝色表示。He:杂合突变体;Ho:纯合突变体; WT/D,用限制性内切酶消化的野生型扩增产物; WT/U,野生型扩增产物没有被消化。

参考文献

Shan, Q., Wang, Y., Li, J., & Gao, C. (2014). Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system. Nature protocols, 9(10), 2395.

Zhen Liang  et al. (2018). Genome editing of bread wheat using biolistic delivery of CRISPR/Cas9 in vitro transcripts or ribonucleoproteins. Nature protocols


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