最近做WB总是出各种问题，要么是背景很脏，要么条带很弱，要么是杂出不是目的条带，自己一边一边也再摸索，一下都是自己失败总结了一点心得。

Western Blot 注意事项

1，             切割稻瘟菌块时尽可能细，不贪多。

2，             液氮研磨尽可能细，全过程带手套和口罩，防止污染样品。

3，             提取蛋白过程全程保持4度低温，提完蛋白放入负80度一定提前分装，避免蛋白反复冻融。

4，             制作PAGE胶之前配置好所需溶液，特别是PH调节要check检查一遍。PAGE温度高，凝固快。

5，             上样，上样之前加入SDS loading buffer，还有CK+，CK-非常重要。

6，             电泳：20mAh两块胶一个半小时左右（根据目的蛋白大小调整），为了好看也可以适当调低。

7，             转膜：电泳结束前提前配置好转膜buffer，放入冰箱预冷，转膜一般条件是300mAh 1小时30分钟；350mAh是1一个小时。（这个条件适合转20-70kda大小的蛋白，如果目的蛋白过大或过小可以做相应的调整）

8，             封闭：5%脱脂牛奶封闭1小时，也可以选择更久，或者4度过夜。

9，             一抗：可以选择一抗（5%脱脂牛奶配置，一抗可以重复使用3-5次）4度过夜，换二抗时用TBST洗三遍，每次8分钟。

10，        二抗（5%脱脂牛奶配置）：一个小时。

11，        显影：AB液混合好，覆盖至膜上，2分钟后可以进暗室拍照。

12，        以上8-9步换液体时不要直接倒在膜上。