张辰宇“miRNA重大发现”后的国际研究动态---科学网版

                                                             --兼评反转人士的鼓噪

                                                               王大元     贾士荣

科学网版的前言： 一个月前，才子薛宇教授在科学网发表了一篇题为“从细胞外RNA到跨物种调控：张教授的异想天开”的精彩博文：

http://blog.sciencenet.cn/home.php?mod=space&uid=404304&do=blog&id=900756

薛教授宇文笔了得， 常在嬉笑怒骂之间写出说理清楚，水平高，可读性强的博文，引起了我的兴趣  于是我开始查找有关文献， 遂成此文---DYW。

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提要：多家欧美知名实验室的科学家未能重复出“植物中的miRNA可以通过口服跨界转移到动物体内”这一结果；即便这一结果成立，也丝毫无关于转基因食品的食用安全性。

2012年， 南京大学张辰宇教授及其团队在Cell Research杂志（22(1)，2012）上发表了一篇有关小RNA（miRNA）的论文（为叙述方便，以下简称“张文”）， 该文在国内外相关领域引起重视。

“张文”的要点是：口服植物食品，植物中的小RNA可以进入动物和人体内， 並能调节肝脏的生理功能。如果这能被确证，则在国际上就是一个重大的发现：植物的小RNA可以通过口服，从植物食品转移到动物，并调控动物基因的表达，即miRNA在植物界和动物界之间可以实现“跨界基因调控”（cross-kingdom gene regulation）。它暗示是否可用此途径来研制口服RNA新药，治疗或控制某些重要疾病。即使没有普遍性，仅存在于有限的物种之间（如他们发现在小鼠中存在水稻的miR168），也是一个很有意义的发现。

从科学发展角度看，这本来是一件很正常的事；并且很明显，这一研究结果如果成立，首先是对已有的生理学知识构成挑战。奇怪的是，个别记者硬是把它与转基因作物联系起来，杜撰和编造了这是“转基因作物非常真实的危险”。“反转”人士更是如获至宝，似乎抓住了一根救命稻草，乘机造谣攻击，蒙骗公众，将转基因作物进一步妖魔化。

其实，张辰宇教授本人并没有把他们的实验结果与转基因作物的安全性联系起来，可以说“连想都没有想过”。他们在文章中只是说：“水稻中的一些小且易碎的核酸分子，在经受许多消化吸收屏障后仍能存活，并最终下调小鼠肝脏基因的表达，可能影响其胆固醇水平”（The actual  researchers  who  performed  this preliminary work had claimed that thesmall, fragile nucleotide molecules from rice were somehow capable survivingnumerous barriers of digestion and absorption to ultimately turn down geneexpression in mouse livers, possibly impacting their cholesterol levels ， Zhang  等,  Cell  Research,  2012）

一个新的科学发现必须接受同行实验重复验证和严肃认真的科学讨论，然后才能得出正确的结论。“张文”发表到现在3年半过去了，国际上不少重复实验的结果也已陆续发表，随着时间的推移，结论已经比较明晰。本文提供一些最新的数据、评论和结论。

植物和动物细胞里都有自己特有的 miRAN，它在生长发育中起着一定的调节作用（可查miRNA数据库）。下表中列出了各种农作物、水果、蔬菜中高表达的小RNA。

检测miRNA的方法有多种，如：微阵列（基因芯片）法（microarrays）、定量反转录PCR法（qRT-PCR，PCR为聚合酶链式反应的简称，是快速检测基因的常用方法）、数字PCR（digital PCR）、测定RNA碱基序列等等。由于这些方法的灵敏度很高，可测出含量很低的核酸分子；但因为核酸普遍存在，测定中因核酸污染造成的假阳性也很常见。当检测出的miRNA含量很低时，首先要考虑的是，是否存在污染或仪器的背景噪音，而不应马上为你测出了极低量的小RNA分子而狂喜。

迄今重复实验的结果已有不少报道，归纳起来有两方面：一是测出的植物miRNA更可能是污染，是假象；二是植物miRNA在动物体内表现生理功能的可能性很小。

1，测出的植物小RNA可能是污染，是假象

Snow等选择了3种普遍食用的富含小RNA(MIR156a、MIR159a、MIR169a)的水果（苹果，香蕉和鳄梨）作为检测对象。这些miRNA高度稳定，且易于检测。检测常吃这些水果的健康运动员的血浆，结果是：人类本身具有的miR-16能够检测到，但没有检测到口服的三种植物miRNA（Snow 等，Ineffective delivery of diet-derived  microRNAs to recipient animal  organisms.  RNA Biol. 10，2013）。

蜂蜜、蜜腺和花粉是蜜蜂的主要植物性食源，其中含有较高的MIR156a、MIR159a和MIR169a。在分析蜜蜂肠道时，可以检测到蜜蜂本身具有的miRNA let-7，但检测不到植物来源的MIR159a和MIR169a，在每个细胞中只检测到一个MIR156a（Snow 等，RNA Biol. 10，2013）。

用富含植物miRNA（MIR156a、MIR159a、MIR169a）的蔬菜或大豆以及含动物酪蛋白或猪油的食品（含动物miRNA，没有植物miRNA）分别饲喂小鼠，然后检测小鼠血浆。没有检测到植物性的MIR159a和MIR169a。MIR156a在一个细胞中最多检测到1个（Snow 等，RNA Biol. 10，2013）。

Snow按照“张文”的实验设计，将未经处理的富含MIR156a、MIR159a和MIR169a的鳄梨饲喂小鼠，可以检测出动物性的miR-16，除偶然检测出极低量的MIR156a外，也没有检测出任何痕迹的植物MIR159a和MIR169a（Snow 等，RNA Biol. 10，2013）。

一些实验室给动物饲喂不含有植物miRNA的饲料，竟然发现动物体内也有植物miRNA（Zhang Y等，Analysis of plant-derived miRNAs in animal small RNA datasets. BMC Genomics 13，2012）。

Witwer等用灵长目动物猕猴做了类似的实验，喂食富含植物miRNA、不含动物miRNA的大豆和水果做成的奶昔类似物（shake）。饲喂后1、4、12小时采集血浆，用一种新的特异的RNA纯化试剂盒和定量反转录PCR方法检测。植物性的miRNA（MIR160、MIR166、MIR167、MIR168和MIR172）都没有检测到。用灵敏度极高、可以检测出非常低含量植物miRNA的微滴数字PCR（Droplet digital  PCR）法，也没有检测到植物性的miRNA（Witwer K.W.等）。

以上实验的一致结论是：采用多种灵敏度极高的检测技术，对灵长类动物，小鼠以及昆虫做的饲喂植物性miRNA的实验，都没有能证实“张文”的结果，所以有人很保守地说，这最多只是“一个实验室特殊技术或特殊实验条件下的结果”（reflect a lab-specific technical or  experimental condition），而不是“一个普遍的生命现象”（a general biological   phenomenon ）。

2013年英国Newcastle大学的Dickinson用小鼠做重复实验，得出结论认为小鼠口服大米后，缺乏植物性小RNA进入血浆和肝脏的证据（Lack of detectable oral bioavailability of plant  microRNAs after feeding in mice. Nature Biotechnology 31（11），2013）。实验分以下处理：

表格的文字说明见下：
处理1：人工合成饲料（高度纯化，完全去除植物性成分），测血浆；
处理2：人工合成饲料， 测肝；
处理3：营养平衡饲料（人工合成饲料加40%大米，含54 fmol/g水稻miR168a），测肝；
处理4：单喂大米饲料（大米占75%，含水稻miRNA），测肝

饲喂小鼠1、3、7天后，取小鼠的血浆和肝脏做RNA测序，检测结果显示：
饲喂大米的处理，每100万个miRNA中仅检测出4-16个类似于水稻的小RNA。
只喂食合成饲料（没有植物性miRNA）的处理中，也能检测出类似于水稻的miRNA，其含量与喂食大米饲料的小鼠差不多。

这些与水稻小RNA类似的序列，经鉴定与miR414相似，在水稻谷粒中检测不到它，但在所有小鼠样本中都能检测到相似的量，不管饲喂什么样的饲料。同时，用定量PCR法检测饲喂三种饲料的小鼠肝脏和血浆，也没有检测到水稻的miR168a。

Dickinson认为，测出的与水稻小RNA类似的序列，可能是测序错误、即假象（artifact）或核酸交叉污染所引起。他列举了三点理由说明植物食品中的小RNA进入动物和人体血浆及肝脏缺乏证据。（1）Zhang Y.等 (BMC Genomics 13：381，2012)报告，经普查大量的动物小RNA公共数据库，没有证据说明有任何主要植物来源的小RNA在动物样本中积累；（2）口服RNA药物因常常被消化降解很少能成功生效；（3）植物小RNA有长期安全食用的历史，没有证据说明小RNA被吸收并有生理功能。

Dickinson的重复实验中还测定了小鼠的低密度脂蛋白（LDL，low density lipoprotein），发现生食（未经煮熟）75%大米的小鼠，3天和7天后血浆中的LDL显著增加，但饲喂营养平衡饲料（含40%大米和54 fmol/g水稻miR168a），小鼠的LDL则正常，没有增加，尽管实验中加入的水稻小RNA比“张文”中用的量高22倍。故“张文”所说的LDL增加，不是由于水稻中的小RNA（测不出）产生什么生物学效应，而是因为仅仅生食大米、营养不平衡造成，因为饲料中的脂肪、胆固醇和蛋白质比啮齿动物的标准饲料要低。

由于Dickinson的实验结果直指张辰宇，张辰宇教授对Dickinson的报道做了回答（“Reply to Lack of detectable oral  bioavailability of plant microRNAs after feeding in mice”）。有兴趣的读者可以去查阅，在此不再多做介绍。

今年5月（2015年5月），美国科学院举办了有关miRNA的专门论坛。论坛上认可Dickinson的工作，引用了他的实验数据，而且还作了进一步的发挥。

2，植物miRNA在动物体内表现生理功能的可能性很小

由于国际上基本没有实验室能够在动物和人类的血液和组织中检测到口服植物的miRNA，所以没有人能去检查植物miRNA在动物体内所表现出的生理功能。

在美国科学院的论坛上，哈佛医学院的一位教授作了一个主题报告，下面摘取他报告的2张幻灯片。.

第一张幻灯片指出，即使动物物体内检测出植物性miRNA，因其在食物中的含量太少，不足以行使miRNA的调节功能（下图）：

图中明确指出，如果在动物中确有口服植物miRNA的话，要行使其生理功能，必须达到每个细胞中有100个拷贝的miRNA才有可能。要达到这个量，需要一次吃1670公斤哈密瓜。水稻上也已有人做过计算，需要一次吃33公斤大米才有可能（见：Safety assessment of food and feed from biotechnology-derived crops employing RNA-mediated gene regulation to achieve desired traits: A scientific review. Regulatory Toxicology & Pharmacology 66：167–176，2013）。

第2张幻灯片是这位哈佛医学院教授的结论：

以上只是简介最近的国际研究动态和进展，绝无对张辰宇教授不恭之处。

下面要特别说一说miRNA与转基因作物的安全性问题。

“张文”发表后，国内的“反转”集团不久就掀起了一股声势浩大的反转舆论，说张教授的结果冲击了转基因作物及其食品的安全性。那么把miRNA与转基因安全联系起来是怎么来的呢？

现在查到的源头文章是一个叫Ari LeVaux的记者发表在《大西洋》（The Atlantic ）杂志上的一篇文章，题为“遗传改良食品非常真实的危险”（“The very real danger of genetically  modified foods”）。 其中说：“ 中国南京大学的研究者发现吃了米饭后，水稻里的小片段核酸（RNA）到了人的血液和器官里，与人的肝脏细胞受体结合，影响肝脏从血液中吸取胆固醇。”（Chinese researchers have found small pieces of rice ribonucleic acid (RNA) in  the blood and organs of humans who eat rice. The Nanjing University-based team showed that this genetic material will bind to receptors in human liver cells and influence the uptake of cholesterol from the blood）。 文章渲染来自水稻的miRNA损害了小鼠的基因表达。

2015年 5月在美国科学院论坛上，很多行内科学家和记者指出了《大西洋》杂志文章的许多谬误。 记者Ari LeVaux后来也撤回了他的一些论点。但一些人仍然把这篇文章作为“救命稻草”，反对转基因，国内反转份子散布“miRNA冲击转基因安全性”的谣言，也全都来自 The Atlantic  杂志的这篇文章。

人类吃稻米已有5000年以上的历史，全世界50%以上的人口，特别是亚洲以稻米为主粮，如果水稻里的miRNA对人有害的话，试想今天会是什么样的情景？

农作物、水果、蔬菜中历来存在小RNA，并不是有了转基因作物后才有小RNA。植物性食品的长期安全食用历史，说明小RNA既与传统非转基因植物食品的安全性无关，也与转基因作物（GMO）食品的安全性无干，两者之间扯不上任何关系。反过来说，如果“小RNA冲击GMO食品的安全性”，那也一定会“冲击传统非GMO食品的安全性”。以上列举的国际最新研究结果表明，动物血液和器官中测不出植物的小RNA，它更不可能在动物中行驶其调节基因表达的生理功能。这是很浅显的道理和确凿的事实，显然，反转者的鼓噪和责难只能是梦呓，在明眼人面前，各种谎言和谣言本来就不堪一击。