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四十不惑:DNA测序技术前世今生和未来

已有 6900 次阅读 2017-10-13 11:10 |系统分类:科研笔记| DNA测序, 综述

这篇综述回顾了DNA测序技术发明四十周年以来的发展历程,规模从几个碱基对第一个人类基因组,我们已经见证了多个技术革命和增长,现在获得的百万人和其他多种的基因组。DNA测序技术已被广泛地使用,包括作为一个广阔的分子的计数器。我们预测,从长远来看,DNA测序的影响将可与显微镜相提并论。

1.DNA测序技术的历史

早期测序

最早是胰岛素(蛋白质)和tRNA早于DNA完成了测序。其中,第一个RNA测序用了140kg的酵母测出了76个核苷酸。

DNA测序技术的发明**

1973年Gilbert和Maxam引物延伸法测定了24个核苷酸,每个核苷酸在耗时一个月。
1976年Sanger和Coulson链终止法和Gilbert和Maxam化学裂解法。
1979年鸟枪法测序
1987年Smith、Hood和Applied Biosystems开发了桑格法荧光测序仪,1000base/d。
1982年Genbank上存储了500,000bases.
1986年Genbank上存储了10,000,000bp.(统计数据见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/statistics/

扩大到人类基因组

1.几个显著进步:1)从染料标记的引物到染料标记的末端; 2)突变的T7 DNA聚合酶; 3)线性扩增反应;4)基于磁珠的DNA纯化和提取;5)PE双端,双链测序;6)毛细管电泳;7)工业化标准的加入。
2.软件的开发:phred,质量度量Q值, phrap, the TIGR assembler and the Celera assembler
3.测序成本的下降:2001年一个测序中心可以测10,000,000bp/day. 2004年¥1/(600-700bp).
4.和HGP计划平行进行的私人基因组测序Craig Venter and Celera (2001)。

大规模平行DNA测序

1.核心是体外扩增产生每个模板拷贝被测序,而不是细菌克隆。
2.几种扩增方式有polonies,桥式pcr或者滚环扩增(纳米球)。
3.边合成边测序的三种方式:1)焦磷酸测序2)使用DNA连接酶的特异性荧光寡核苷酸模板附在顺序的方式3)聚合酶介导下逐步加入荧光标记的脱氧核苷酸(1998, Solexa)
4.第一个NGS测序平台是454(2005), 然后是Solexa(35bp PE)。
5.几个NGS平台454(Roche收购),Solexa ( Illumina收购), Agencourt (Applied Biosystems收购), Helicos (founded by Quake), Complete Genomics (founded by Drmanac华大收购) , Ion Torrent (founded by Rothberg)。
6.2012年454, SOLiD 和 Helicos停止开发,illumina成为主流,尽管华大是个潜在挑战者。准确度99.9%,Novaseq可以两天内产生1百亿reads,是HGP计划23G的40倍。

单分子实时测序

1.PacBio:零模波导孔,大于10k的读长,10%的原始错误率,很低的gc偏好性。
2.纳米孔测序:Oxford Nanopore Technologies (ONT),最长读长可达900K, 便携式,电信号检测,但是错误可能不是随机的。

3.两者均可检测碱基修饰,甲基化等。


DNA测序的应用






































1.基因组的de novo组装

(1)遗传图谱(2)物理图谱(3)双端测序,8-10冗余,1/100,000的错误率(4)Celera, 从贪婪算法(phrap and the TIGR -assembler)到基于图的方法(重叠–布局–-共识)(5)de Bruijn graphs (如 EULER and Velvet)(6)高分子量high molecular weight (HMW)(7)HiC
2.基因组测序
1)重测序:Bowtie and Burrows–Wheeler Aligner (BWA)数据压缩,SAMtools and laterGATK。
2)几个计划:Genome Aggregation Database (http://gnomad.broadinstitute.org/)
NHLBI TOPMed (TransOmics for Precision Medicine, [https://www.nhlbiwgs.org/])

测序的临床应用

1.无创产前诊断 non-invasive prenatal testing (NIPT)
2.WES: Mendelian and neurodevelopmental disorders
3.癌症:靶向治疗、非侵入性诊断和监测ctDNA, cfDNA,发现新的突变位点。

4.测序仪作为分子计数装置:RNA-seq取代芯片,TopHat and Cufflinks(http://enseqlopedia.com/


宏基因组测序DNA测序技术的未来100%基因组,没有任何gap;人口规模的测序;生物学的发展(单细胞RNA-seq、基因编辑);实时、便携式测序仪;非常规使用(DNA合成等);DNA测序作为新的显微镜。






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