Last Updated 20/03/2018 by Hantsing Wang

器材：纸杯，剪刀，烧杯

一、麻醉剪鱼尾鳍：

从系统中取出需要鉴定的鱼，烧杯中加入Tricaine（Tricaine麻醉剂用量，5g/L存储,约1:20稀释，200-300mg/L麻醉用。），将鱼置于烧杯中至昏迷，纸杯中加系统水，减去2/3尾鳍，剪一次洗一次酒精擦一下，尾鳍置于已经编号的tube（1.5ml管）中，鱼放入对应编号的纸杯。

二、DNA提取：

①tube中加入150ul，50mM NaOH溶液（要测pH看是否为碱性，用2M NaOH配制），离心使鱼尾在管底，在95℃金属浴中加热40-60min左右（至组织完全消解，溶液呈黄色），每20-30min震荡一次；

②将tube置于4℃冰箱冷却1-2min，在加入（1/10体积）15ul的1M Tris-HCl，pH7.5中和；

③在4℃，12000rpm离心15min，将上清液移到另一管中，做好标记（若不进行鉴定，可在-20℃贮存）；

三、PCR扩增：（25ul体系）（加液从大到小）

Taq DNA polymerase：（溶解在甘油里，每管分开了加，效果好）

①rTaq 0.2ul(buffer含Mg2+，若无，需要加Mg2+，2ul)(5U/ul)

 ②EX-Taq 0.2ul

酶活力大小有2个单位，kat和U。1min内能转化1umol底物的酶量称为1酶单位（U），1s内能转化1mol底物的酶量为1 katal（简称kat）。它们的换算如下：1 kat=6*10^7 U，1U=16.67n kat。 

PCR反应：

①充分变性（93℃-95℃，4min）

②循环条件：（30-40 cycles）

变性（93℃-95℃，30s）

退火（55℃-65℃，30s，温度根据引物设计调整）

延伸（72℃，根据引物设计产物长度）

③充分延伸（72℃，15min）

④4℃保存

转基因鱼，GFP的编码序列是700多bp，编码一个238个氨基酸的蛋白。蛋白质分子量26.9KDa，（1kDa=1000摩尔质量）。

GFP 之所以能产生绿色荧光是由于其蛋白分子多肽链内含有特殊的生色团结构, 即第65-67 位氨基酸Ser- Tyr- Gly 链内环化加氧形成对羟苯甲基咪唑环酮, 和周围其它三个氨基酸形成六肽生色团。

四、琼脂糖（agarose）凝胶电泳

琼脂糖具有亲水性，不带电，DNA在碱性环境下带负电，EB可镶入DNA分碱基中形成荧光络合物，DNA分子片段长度，构型不同，泳动速率不同，紫外光照射下形成不同区带。

①闭环（超螺旋）②开环③线形的螺旋率依次降低。在琼脂糖电泳的前后顺序是：

①闭环（超螺旋）>③线形>②开环。开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链，因此电泳速度最慢。判断质粒质粒好坏的一个指标就是超螺旋质粒在所以质粒中的含量。

溴化乙锭（EB）（冷却至60℃左右），终浓度为0.5ug/ml（EB储液，4℃保存，一般是配成浓度为10mg/ml）

10³ul=1ml，1g=10³mg=10⁶ug=10⁹ng=10¹²pg

小胶：0.3g 琼脂糖 + 30ml TAE + 1.5ul EB

大胶：0.5g 琼脂糖 + 50ml TAE + 2.5ul EB（琼脂糖：TAE：EB = 1g：100ml：5ul）

室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔梳子。

小孔胶5ul Marker，大胶大孔加10ul Marker，易扩散，最后加Marker

0.1ul Loading Buffer（载样缓冲液）+ 1ul DNA样品，混匀后1.1ul

DNA样品：Loading Buffer=10ul:1ul混匀，小孔最多10ul；中孔25ul；大孔50ul。

跑胶使用std模式，电压恒定在100V左右，样品跑过1/2，不超过2/3停止。

研究院在四楼成像。

电泳：1%琼脂糖凝胶，一般90-110V电压，电泳20～40min即可。

备注：

一、配制缓冲液

1.Tris-硼酸（TBE）(Tris-Borate-EDTA)

使用液浓度：0.5×：0.025mol/L Tris-硼酸 0.001mol/L EDTA

储存液配制：5×：①54g Tris碱 ②27.5g硼酸 ③20ml 0.5mol/L EDTA（pH=8.0，4.65g Na₄EDTA，分子式：C10H12N2O8Na4），采用ddH2O溶解混匀，pH是8.3，不需要调整，溶液体积1L。

2.Tris-乙酸（TAE）(Tris-Acetate-EDTA)

【由三羟甲基氨基甲烷(Tris base)、乙酸(acetic acid)、乙二胺四乙酸(EDTA)组成缓冲液】

使用液浓度：1×：0.04mol/L Tris-乙酸 0.001mol/L EDTA

储存液配制：50×：①242g Tris碱 ②57.1ml冰乙酸 ③100ml 0.5mol/L EDTA（pH=8.0），

采用ddH2O溶解混匀，NaOH调pH至8.5，溶液体积1L。

二、使用方法：

如果要将50×母液稀释成2000ml工作液，需要取40ml母液，加入1960ml水混匀即可，2000ml终体积除以40ml体积母液就是50倍。

Tris-磷酸（TPE）：

浓贮存液（每升）：10×：①108g Tris碱 ②15.5ml 85％磷酸（1.679g /ml）③40ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)   

使用时再稀释10倍。

TAE 与TBE 緩冲溶液的成份：

50x TAE Buffer (Tris-Acetate-EDTA)
242 g ----------- Tris base
57.1 ml ----------- Acetic acid
100ml ------------ 0.5M EDTA
Add ddH2O to 1 liter and adjust pH to 8.5.

10x TBE Buffer (Tris-Borate-EDTA)
108 g--------------- Tris base
55 g --------------- Boric acid
9.3 g --------------- Na4EDTA
Add ddH2O to 1 liter.
The pH is 8.3 and requires no adjustment.

它们的区別有下列几点：

1. TBE 不能太浓 (它只可有 10 times（倍）)，因為 borate 会很容易沉淀，但一般有少许沉淀是不会有太大问題。
2. TBE 的 缓冲能力(buffering capacity) 比 TAE 高，用 TBE 来跑出來的胶(gel)，分辨率 (resolution) 会比較高。
3. 因为 TBE 有 borate 离子 (ion)，它会影响酶 (enzyme) 的工作。因此，若要为分离出的 DNA 进行下一步酶处理，如克隆、限制性酶切 (cloning/restriction cut) 的话，就要切记不要让 DNA 碰上 borate ion。
4. TAB 的 缓冲能力(buffer capacity)比较差，gel一般比較模糊，但它不会对影响酶的工作。

TE溶液中含有Tris碱（base）、EDTA。

TE溶液加入硼酸（borate）成为TBE，加入乙酸（acetate）成为TAE

Tris全名是Tris Base, tris(hydroxymethyl)amino-methane

三羟甲基氨基甲烷；2-氨基-2-（羟甲基）-1,3-丙二醇