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传染性蛋白的负面和正面(一) 打破分子生物学中心法则... 精选

已有 6893 次阅读 2018-2-21 09:35 |系统分类:科普集锦

传染性蛋白的“负面”和“正面”(一)

打破分子生物学中心法则的传染性蛋白

文章摘要

蛋白质是生命活动的执行者,除了催化数千种化学反应,蛋白质还在生物的身体结构、信息传递、生物防卫等方面起不可缺少的作用。不同的生理功能不仅需要不同的蛋白质,还需要蛋白质分子形成各自的结构和形状。而蛋白质分子是由不分支的肽链组成的,从新合成的肽链到具有特定三维结构和有生理功能的蛋白质,需要复杂精细的肽链折叠过程。由于各种折叠方式之间的能量差别甚小,许多因素,包括自身浓度的变化、分子中一部分肽链缺失或者延长、基因突变引起的氨基酸残基改变、环境中酸碱度改变、离子浓度变化、周围的分子环境变化等,都能够使肽链的折叠方式发生改变。肽链折叠方式改变的后果之一,就是形成特殊的b-折叠:肽链中彼此平行而又方向相反的区段以氢键联系,形成片状结构,多个分子的这种片状结构还能逐层叠加,形成纤维状的聚合物。不仅如此,这样的结构还会使“正常”的蛋白也改变折叠方式,变成和自己一样的结构,因此这些结构的蛋白质具有“传染性”,也就是能够复制自己的结构,统称“传染性蛋白”,从英文的Prion一词意译而来。在许多情况下,这种“折叠错误”的蛋白会丧失原有的生理功能,而且其聚合物对细胞有害,引起疾病,包括疯牛病、痒羊病、人类的克-雅氏病、老年痴呆、帕金森氏症、杭廷顿氏症等中枢神经系统病症。除了这些疾病,折叠错误的蛋白还可以沉积在身体各处,引起各式各样的“淀粉样变性病”(Amyloidosis)。另一方面,Prion型的蛋白由于其稳定性和特殊结构,又可以获得新的生理功能,在生物材料的建造,物质储存、作为黑色素和牙釉合成时的模板、动物的长期记忆、以及免疫系统的信息传输中发挥重要作用,即一些传染性蛋白也能够发挥正常的,甚至不可替代的生理功能。本文以三个部分分别介绍传染性蛋白被发现的历史和形成机制、传染性蛋白所引起的疾病(负面),以及传染性蛋白执行的正常生理功能(正面)。


      1958年,DNA双螺旋结构的发现者之一的佛朗西斯·克里克Francis Crick)提出了分子生物学中的中心法则The central dogmaof molecular biology)。按照这个法则,信息在生物大分子之间的流动是有方向性的:DNA(脱氧核糖核酸)分子中储存的信息可以经过mRNA(信使核糖核酸)流向蛋白质分子,RNA(核糖核酸,包括信使核糖核酸)中的信息也可以反向传递回DNA,但是储存在蛋白质分子中的信息却不能反向传回RNA或者DNA,也不能传给其它蛋白分子。这几句话比较抽象,下面具体“翻译”一下。

DNAdeoxynucleic acid,其中下面带横线的字母被用于缩写中)是由四种脱氧核苷酸线性相连组成的生物大分子,这四种脱氧核苷酸叫做脱氧腺苷酸、脱氧鸟苷酸、脱氧胞苷酸和脱氧胸苷酸,分别用英文字母AGCT代表。“脱氧”(deoxy)不是说这些核苷酸分子中没有氧原子,而是这些核苷酸的组成成分之一的核糖中,一个羟基(-OH)被氢原(-H)子取代,所以少一个氧原子。这四种脱氧核苷酸在DNA中的排列顺序(即序列)就是DNA储存信息的方式,类似于英文用26个字母按一定顺序排列写出含有信息的文章。在这些信息中,一种是为蛋白质中的氨基酸序列编码的,每三个核苷酸序列对应一种氨基酸,例如GAT对应天冬氨酸,GAA对应谷氨酸,AGA对应精氨酸,CAC对应组氨酸等,叫做为蛋白编码的“三连码”(triplet code)。这些信息在基因表达(即信息输出时)时先转录(transcription,意思是“信息转抄”)在mRNA上,即以DNA为模板合成mRNA。被合成的mRNA分子和模板DNA分子有相同的序列,包括为蛋白编码的三联码,只是脱氧胸苷酸T变成了尿苷酸U,脱氧核糖变成了核糖。合成的mRNA分子再作为DNA的“替身”,在核糖体中指导蛋白质分子的合成,核糖体按照mRNA分子中三联码出现的顺序,把对应的氨基酸依次加上,蛋白质就被合成了。这个过程叫做“转译”(translation),意思是核苷酸序列中存储的信息到这一步才被“翻译”为蛋白分子中的氨基酸序列。

由于RNADNA一样,都是核酸,化学结构极其相似,它们之间也可以进行碱基配对,所以储存在RNA分子中的信息可以反向流回DNA,即以RNA为模板合成DNA。这个过程叫“反转录”(reverse transcription),意思是把以DNA模板合成RNA的转录过程反过来。同理,RNA也可以用自身为模板,合成RNA,使得含RNA的病毒能够复制自己的RNA。所以RNADNA一样,所含的信息是可以输出的。

但是蛋白质分子就不一样了。蛋白质分子中氨基酸的序列,像DNA分子中脱氧核苷酸的序列一样,也含有信息,而且和DNA中编码部分的信息是等价的(因为二者有对应关系),但是这样的信息不能被生物所读取而加以利用,也就是蛋白质分子中的信息不能被输出,例如不能将蛋白质分子中包含的信息反向转变为RNA分子中的核苷酸序列,或者DNA分子中的脱氧核苷酸序列。而且和DNARNA能够以自身为模板复制自己不同,蛋白质分子也不能以自身为模板,合成新的蛋白质。

从理论上讲,把蛋白质分子中的氨基酸序列变回DNA中的脱氧核苷酸序列还是有用的,例如某个基因发生了突变,或者被删除,如果原先合成的蛋白质还在,编码基因的信息也就还在,原则上是有可以从这些蛋白质的氨基酸序列再“造出”mRNA分子中的核苷酸序列,或者DNA分子中脱氧核苷酸的序列的,这样受损的基因就有可能被修复。这个过程相当于产品设计书丢失时,如果产品还在,是有可能从产品的结构再写出设计书的。具体步骤可以把核糖体中mRNA分子指导合成蛋白质的步骤反过来,比如让能够“认识”氨基酸的转移RNAtRNA)用“反密码子”指导mRNA的合成。但是这样做要遇到大量的困难和问题,带来的“麻烦”和“代价”多于“好处”,所以从“中心法则”被提出后的几十年中,信息从蛋白质分子流回mRNA分子或者DNA分子的机制还没有被发现,或许根本就不存在。同样,蛋白质分子用自己做模板,合成和自己相同的蛋白质(即蛋白质在没有DNAmRNA的情况下自我复制)的机制也没有被发现,或者也根本不存在。所以克里克的“中心法则”仍然是基本正确的。

DNA中的另一类信息不是为蛋白质编码,而是作为基因的“开关”,这些信息序列结合控制基因表达的蛋白分子,决定基因在什么时候,什么地方被“打开”,输出信息,合成RNA和蛋白质。

DNA分子储存的这两种信息对于生命都是必需的。没有为蛋白质编码的信息,蛋白质无法被合成,没有基因的“开关”,就不能根据需要在不同的时间和环境条件下合成不同的蛋白质。这两种信息在生物繁殖时会传给下一代,在那里输出信息,指导下一代生物的生命活动,因此DNA中储存的信息又叫做“遗传密码”。而蛋白质分子中的信息既然不能再输出,蛋白质也就不能作为遗传物质,把生物的信息传给下一代。

由于这个原因,引起传染病的生物,无论是细菌、病毒、还是真核生物(例如疟原虫),都必须含有DNA或者RNA(对某些病毒而言),否则这些生物在寄主中就无法繁殖。蛋白质由于不能将自身的信息输出而合成DNA或者复制自己,在理论上是不可能引起传染病的。

但是这样的预期在上个世纪90年代被意外地打破了,这就是单纯由蛋白质引起的传染病“疯牛病”和“痒羊病”。

疯牛病和痒羊病是通过蛋白质传染的疾病

1986年,英国报道了一种传染病病,叫牛海绵状脑病(Bovine spongiform encephalopathyBSE),俗称“疯牛病”。十几万头牛受到感染,被感染的牛中枢神经系统发生病变,脑中出现海绵样空洞、病牛行为反常、步履不稳、对触摸非常敏感、消瘦,最后死亡。追查牛疯牛病传染的路线,发现是因为欧洲一些国家用牛屠宰后废弃的组织和骨头制成饲料再用来喂牛,叫做“肉骨粉”(Meat and Bone Meal),疯牛病得以通过肉骨粉传染给健康的牛。

通过进食同类生物的组织而被传染上疾病的情形也发生在人身上,这就是巴比亚新几内亚(Papua New Guinea)的弗雷人(Fore people)所患的库鲁病(Kuru)。患者身体震颤(Kuru在当地语言中就是震颤的意思),行动失调,脑退化痴呆,发音困难,情绪不稳,突然爆发笑声,吞咽困难,常常在症状出现后数月之内死亡。调查发现,这种疾病与当地的一种习俗有关。弗雷人在葬礼仪式上会吃掉死者的身体,认为这样可以帮助死者的灵魂得以释放。在20世纪60年代,这种风俗被停止后,死于库鲁病的人就大幅下降,从1957年的200人死亡到2005年的零死亡,说明库鲁病的确是通过吃死者的身体传染的。为了进一步证实这种机制,美国科学家Daniel Carleton Gajdusek从一个死于库鲁病的弗雷女孩身上取得脑组织,将其移放到黑猩猩的脑上,结果一只黑猩猩在不到两年的时间内就发展出了库鲁病,证明病人的脑组织中的确含有传染源,而且还可以跨物种传播。

与疯牛病类似的神经系统病变是人类的克-雅氏病(Creutzfeldt–Jakob diseaseCJD),由德国病理学家Hans Gerhard CreutzfeldtAlfons Maria Jakob1920年最早记述。患者记忆出现问题,行为改变,运动失调,随后出现痴呆,通常在症状出现后一年之内死亡。将克-雅病人的脑组织移放到黑猩猩的大脑上,黑猩猩也会患同样的病,说明 克-雅氏病和库鲁病一样是可以跨物种传播的。反过来,人吃了受疯牛病感染的牛的脑、内脏和肉也会得类似的海绵状脑病,与已经发现的人类克-雅氏病类似,叫做变异型克-雅氏病(Variant Creutzfeldt–Jakob diseasevCJD)。食用牛肉就可以被传染上疯牛病,而且症状可怕,无药可治,这在世界范围内引起了广泛的恐慌。为了制止传染,英国屠宰了400多万头牛并且加以“火化”,许多国家都禁止进口英国的牛肉,造成巨大的经济损失

这类疾病的传染途径找到了,但是鉴定出具体的致病原却绝非易事。致病原性质的线索不是来自疯牛病的病牛,而是来自对类似于疯牛病的羊神经系统疾病,叫做“痒羊病”(Scrapie)的研究。痒羊病早在1732年就被发现,以病羊在树上、石头上或者羊栏上摩擦身体,以至于毛都被磨掉而得名,scrape在英文中就是“刮擦”的意思。与感染疯牛病的牛类似,感染痒羊病的羊也会步履不稳,行动困难,消瘦,最后死亡。由于羊比牛小得多,痒羊病引起的损失比较小,也还没有传染给人的报道,所以自发现以来并没有像疯牛病那样引起广泛的恐慌,也不如疯牛病那么“有名”。由于发现的时间比较早,科学家们反而可以比较从容地对其致病原进行研究。

与疯牛病和库鲁病需要进食同类动物的组织才能被传染不同,羊并不会吃其它羊的组织,所以感染源也许是羊的尿液、唾沫或者胎盘,这些物质在掉入土壤后,致病因子会长期存留在土壤中。由于羊有吃土的习惯,也许是从土壤中吃进了致病因子,羊也由此感染上疾病。

鉴定痒羊病的感染源是一个漫长而困难的过程。在过去多年的研究中,对痒羊病致病因子的假说有十几种之多,包括各种病毒、类病毒(viroids)、螺原体(spiroplasma,一种致病的原核生物)、肉孢子虫(Sarcosporidia,一种寄生虫)、裸露的DNA、被多糖包裹的DNA、结合在细胞膜上的DNA、多糖等。研究的突破是由美国科学家Stanley B. Prusiner 1982年做出的。他通过大量的实验,证明致病因子并不如许多人预期的那样含有DNA或者RNA,而仅仅是蛋白质。

例如能够使核酸分解的各种核酸酶,包括多种能够水解DNARNA的酶,都对致病因子的效能没有影响。能够破坏DNARNA的紫外辐射也没有效果。为了进一步证明致病因子不含核酸或者病毒,Prusiner还使用了硝酸锌(能够使DNARNA水解)、补骨脂灵(psoralens,在光照时会和DNA形成共价连接,破坏DNA的功能)、羟胺(hydroxylamine,能够杀死绝大多数病毒),这些物质都不能使致病因子的致病性消失。

相反,能够使蛋白结构受到破坏的处理都能够使致病因子的效能消失,包括水解蛋白的蛋白酶(蛋白酶K和胰蛋白酶)、使蛋白质结构破坏的十二烷基磺酸钠(SDS)、硫氰酸胍(guanidiniumthiocyanate)、苯酚(phenol)、尿素、焦碳酸二乙脂(diethylpyrocarbonate,使蛋白质侧链被乙脂基化而失去功能)。

在这些实验结果的基础上,Prusiner构建了“prion”这个词,意思是“传染性蛋白颗粒”(proteinaceous infectious particles)。也许是Prusiner不喜欢这样组成的Proin 的发音,他把其中的字母oi对调,变成“prion”。由于它像病毒一样可以传染疾病,国内将其译为“朊病毒”,其中“朊”就是蛋白质的意思。

在没有DNA或者RNA这样的遗传物质存在的情况下,仅凭蛋白质就可以传染疾病,是一个破天荒的发现,也明显与克里克提出的“中心法则”相抵触,因为它表示储存在蛋白分子上的信息也是可以被输出的。在prion蛋白还没有被提纯鉴定并证明其功能之前,Prusiner自己也没有十足把握,所以他在1982年的文章中把蛋白传播疾病的现象称为“异端”的(heretical),也没有排除致病因子是由蛋白紧紧包裹的核酸组成的可能性,也许是这层蛋白包膜保护了里面的核酸被外来物质或处理降解。尽管如此,Prusiner还是第一个明确提出致病因子为蛋白质并且用大量实验支持他观点的人,并且在随后的研究中继续在这个问题上做出贡献,最终改变了人们的思想观念,他也因此获得了1997年的诺贝尔生理或医学奖。

1984年,Prusiner用他提取的源自痒羊病的致病原,成功地在兔子身上诱导出抗体。使用这个抗体,他在1985年证明引起人类克-雅氏病的致病原是同一种蛋白,也是Prion。使用同样的抗体,科学家在1989年证明引起疯牛病的也是Prion蛋白。这样,在牛、羊、人身上发现的传染性神经系统疾病,都是由同一种蛋白引起的。

1985年,科学家从提取的致病因子,测定了其中蛋白质的部分氨基酸序列,进而找到了为这个蛋白编码的基因,将其命名为Prn-pPrion Protein,斜体小写表示是基因的名称),说明具有传染性的蛋白质是由动物自己的基因编码的。将小鼠的这个基因敲除,小鼠就不再被致病因子感染,表明这个基因与疾病直接有关。

即使是这样,仍然有人对蛋白自身就能传染疾病的说法心存疑虑:致病原是从动物组织中提取出来的,怎么能够担保里面就绝对没有病毒呢?2004年,Prusiner在大肠杆菌中表达了小鼠的prion蛋白片段(残基89-230),在体外将Prion蛋白片段形成小纤维后,再引入表达同样Prion蛋白片段的转基因小鼠脑中,引起了小鼠的神经病变。2013年,中国科学家和美国华裔科学家合作,在大肠杆菌中表达小鼠的prion蛋白片段(残基23-230),将提纯的蛋白用超声处理后,再引入正常(非转基因的)小鼠脑中,也成功地产生了与痒羊病类似的神经系统症状。由于大肠杆菌不含有任何动物组织,这些实验令人信服地证明单一蛋白确实可以引起传染性疾病。

现在的问题是,既然prion是由动物自己的基因编码的,prion也是动物自己的蛋白质,怎么会引起传染病呢?答案就在蛋白质分子结构的改变。

蛋白质引起传染性疾病的原因是因为分子结构发生改变

      蛋白质分子能够传递疾病的“异常”现象促使科学家对其机制进行研究。研究发现,引起疾病的prion蛋白和动物身体里面“正常”的prion蛋白虽然是同一种蛋白,氨基酸序列相同,但是却具有不同的结构。

“正常”的prion蛋白位于细胞膜的表面,通过糖脂与细胞膜相连,叫做PrPc,其中的“c”表示“cellular”,其生理功能还不很清楚。相反,引起疾病的Prion蛋白形状改变,叫做PrPsc,其中“sc”表示“scrapie”,即引起痒羊病的蛋白质。更重要的是,这种改变了形状的prion蛋白自身能够作为模板,将“正常”的prion蛋白变成自己的形状,即不断地把PrPc变成PrPsc,使得体内的PrPsc越来越多,形成纤维状的聚合物,再积累形成“淀粉样”(amyloid)的斑块,导致神经组织的损伤。

以自身的形状为模板,把PrPc变成PrPsc,正是这种蛋白质输出信息的手段,也是它“繁殖”自己的方式。它并不以自身的氨基酸序列为模板,合成新的prion蛋白,而是复制自己的形状,所以它输出的,并不是氨基酸序列的信息,而是分子形状的信息。Prion蛋白就是以这种方式,打破了“中心法则”中蛋白质分子中的信息不能被输出的说法。

PrPsc的“繁殖”,需要PrPc作为“原料”,这就可以解释为什么Prn-p基因被敲除的小鼠不会被传染上痒羊病,因为这些小鼠不能合成PrPc,没有原料供致病的PrPsc“繁殖”。

随后的研究发现,能够引起疾病的蛋白质不只Prion一种,而是有许多种,包括引起人类老年痴呆症的淀粉样前体蛋白(amyloid precursor proteinAPP,见本文第二部分)。这些蛋白也具有复制自己结构的能力,它们也具有传染性。不过与PrPsc可以传染给其它动物不同,这些蛋白质只在动物体内复制自己,不传染给其它动物,所以只是“体内传染”,但是它们的致病原理和PrPsc是一样的。

同时,类似Prion的蛋白质也不一定会引起疾病,而且还可以执行重要的生理功能(见本文第三部分),因此,我们把Prion翻译为“传染性蛋白”,意思是它们可以复制自己,这也符合Prusiner创造Prion这个词时的原意,而且其功能可坏可好,这就避免了“朊病毒”只能是致病源的意思。在本文中,我们还把Prion的意思扩大,包括所有能够自我复制的蛋白质,即有传染性的蛋白质,它们改变形状后的结构也叫做Prion型的结构。

在正常情况下,绝大多数蛋白都只有一种基本结构,以适合自己的生理功能,为什么传染性蛋白会有两种不同的结构呢?这就需要看一看蛋白质分子的结构是怎样形成的。

蛋白质分子中肽链的折叠机制

      蛋白质是生命活动的执行者,除了催化细胞内数千种化学反应,蛋白质还在细胞和身体结构、生物防卫、信息传递上等方面起不可缺少的作用。这里说的“信息传递”,不是传递蛋白分子自身的信息,而是细胞外部和内部的信息,例如细胞表面的受体就是由蛋白质组成的,它们接收各式各样的外部信息,例如光信号、机械振动、温度、压力、酸碱度、渗透压、以及调节细胞生长分化的信号等,再传输到细胞内部。

      不同的生理功能不仅需要不同的蛋白质,还需要蛋白质分子形成各自的结构和形状。形成不同结构和形状的生物大分子理论上可以走两条路线,一种是分支的:像灌木的树枝;另一种是不分支的,即线性的,像毛线绕成线团。前者在每个分支处都需要专门的酶,会使得生物大分子的合成和分解困难许多,所以只限于支链淀粉和多糖这样相对简单的分子。不分支的生物大分子只需要一种酶就可以完成将组成单位合成为大分子或将大分子分解为组成单位的过程,效率要高得多,核酸(DNARNA)和蛋白质这样的生物大分子都是线性的。但是线性的蛋白质分子也带来一个问题,它就像一根细长的绳子,是什么机制让它“绕”成不同的形状的?

      蛋白质是由20种氨基酸线性相连组成的分子。每个氨基酸分子内有一个“中心碳原子”,叫a-碳原子。这个碳原子发出四根化学键,平均伸向空间,与其它原子相连。要直观地了解这四根化学键的方向,可以想象一个四面体,即金字塔那样的形状,与碳原子相连的四个原子分别位于四面体的四个顶角上,碳原子则位于四面体的中心,它与四个原子连线的方向就是碳原子四根化学键的方向。这样,每两根键之间的夹角都是109.5度,所以任意两根化学键都不在一条直线上。

这四根化学键中,一根连上一个氨基(-NH2),一根连上一个羧基(-COOH,其中的两个氧原子都和碳原子相连,其中一个氧原子还和一个氢原子相连),第三根连上一个功能基团,第四根连上一个氢原子。一个氨基酸分子上的氨基和另一个氨基酸分子上的羧基可以彼此反应,脱掉一个水分子而连到一起,形成“肽键”(peptide bond-CO-NH-,其中的氧原子只与碳原子相连,氢原子只与氮原子相连)。多个氨基酸分子这样线性相连,就形成“肽链”(peptide)。第三条化学键所连的功能基团不参与肽链的形成,朝一侧伸出,像长绳子上横向伸出的短绳子,成为“侧链”。肽链卷曲成为最后功能状态的形状,就是我们通常所说的“蛋白质”(protein)。

在分子中,以单键相连的两个原子是可以彼此转动的,就像被一根牙签穿在两头的两个塑料球;而以双键相连的两个原子就不能相对转动,就像两个塑料球被两根牙签穿在一起。肽键中的碳-氮键,看似单键,其实由于氮原子上的一对“未共用电子”和碳-氧双键中的π电子部分重叠,所以这个碳-氮键具有部分双键性质,是不能够转动的,肽键中的四个原子也都位于同一个平面上,相对位置无法改变,像一个刚性的“片”。而a-碳原子与羧基中的碳原子之间的化学键,以及a-碳原子与氨基中的氮原子之间的化学键,是“真正”的单键,所以与a-碳原子相连的羧基碳原子和氨基氮原子是可以转动的,并且带着与它们相连的分子部分一起转动。再加上这两条化学键不在一条直线上,这样就使得肽链的形状得以改变。这是肽链能够改变形状的原因,也使得线性的蛋白质分子“卷”成特定的三维结构成为可能。在生物化学中,“卷”的专业名词是“折叠”(fold)。

肽链改变形状的机制清楚了,现在的问题是,肽链是怎么折叠成具有一定三维结构的分子的?这就是一个非常复杂的过程了,因为牵涉的力作用点数量太多,就连目前世界上功能最强大的计算机都无法加以模拟,但是我们可以形象地加以描述。肽链折叠的过程,总的来说就是分子内的电荷彼此相互作用,包括肽键上的电荷和侧链上的电荷,以及这些电荷与环境中分子相互作用的结果。

      肽键上的氧原子和氮原子都是“电负性”(获取电子的能力)比较强的原子,能够从与它们相连(即共享电子)的原子上多得一些电子,所以带部分负电,所以在肽键(-CO-NH-)中,氧原子和氮原子都带部分负电,而与氮原子相连的氢原子则带部分正电。这样,一个肽键上的氧原子就可以和同一条肽链中的另一个肽键上的氢原子彼此通过电荷相互吸引,形成“氢键”(hydrogen bond)。氢键不是共价键,但却是分子之间或分子内不同部分相互作用的重要力量。

      一条肽链含有许多肽键,但不是任何两个肽链之间都可以形成氢键。a-碳原子上的化学键也不是可以任意角度旋转,带有侧链的氨基酸会在一些角度构成空间障碍,这样相邻或者相距太近的肽键之间就无法形成氢键。在肽键之间“舒服地”形成比较稳定的氢键主要有两种方式。一种是肽链卷成右旋的螺旋状,每个肽键上的氧原子和相隔3个(即第4位)的肽键上的氢原子形成氢键。这样每3.6个氨基酸单位绕一圈,形成所谓的“a-螺旋”(a-helix)。这个螺旋总体看就像一根“圆棍”,侧链从圆棍上伸出,好像树干每3.6圈长出一片树叶。a-螺旋是蛋白质分子中最重要的基本结构之一,它上面伸出的侧链的性质决了这段螺旋的亲水性和亲脂性,例如蛋白分子穿越细胞膜就是通过亲脂的a-螺旋实现的。

      另一种在肽键之间形成氢键的方式不是肽链卷成螺旋状,而是肽链中的一些片段伸直,在这些伸直的片段之间的肽链则弯曲,将这些伸直的片段平行地排列在一起(想象一根绳子在地板上来回弯曲,形成多条平行的伸直部分)。肽链像曲别针那样直接弯回来形成的两根伸直的肽链片段方向是相反的,但是相邻的肽链片段也可以是同方向的,这就需要中间的肽链部分不是简单地折回来,而是要在空中“绕一圈”。这样,一根伸直肽链片段上的肽键就可以和相邻的,同样是伸直的肽链片段上的肽键形成氢键。多条这样彼此以氢键相连的伸展肽链节段就会形成一个大致的平面,就像几根筷子排在一起可以构成一个平面。说是“大致”,是因为碳原子发出的四根化学键不在一个平面上,肽链上的原子不可能都在一个平面上,所以肽链不可能完全伸直,而是有“皱褶”。多个伸直的肽链片段也不一定都在一个平面上,而是可以彼此之间方向有小的转动,形成扭转的平面;也可以两边的肽链片段抬高,形成卷曲的平面。这样形成的结构叫做“b-折叠”(b-sheet),是蛋白质分子中另一个重要的基本结构。简单来说,就是a-螺旋像“棍”,而b-折叠像“片”。

还有一些肽链部分既不在a-螺旋中,也不在b-折叠中,肽键的结构常常是无定形的。所以蛋白质分子中肽链的形状可以分为三类,在a-螺旋中的,在b-折叠中的,以及不在这两种结构中的。这三种结构各有自己的空间排布形式,在不同方向上的光学性质也不一样,对左旋圆偏振光和右旋圆偏振光的吸收程度不同,称为“圆二色性”(Circular Dichroism, CD)。通过测定蛋白物质的圆二色性,就可以知道其中a-螺旋和b-折叠的含量。

除了肽键,许多侧链也是带电的,例如谷氨酸和天冬氨酸的侧链因为有羧基,所以带负电;赖氨酸、精氨酸和组氨酸的侧链上还有氮原子,带正电。丝氨酸的侧链上有羟基(-OH),半胱氨酸的侧链上有巯基(-SH),它们上面的氢原子都带一些正电。这些电荷也会彼此作用以及与肽键上的电荷相互作用,影响肽链最后形成的形状。

除了分子内电荷的相互作用,蛋白质分子是溶在水中的,而水分子就是带电的分子,其中的氧原子带部分负电,两个氢原子带部分正电。不仅水分子之间可以形成氢键(这是水的沸点如此之高的原因),水分子和蛋白质中带电的部分也会形成氢键;水中溶解的带电离子,包括钾、钠等正离子和氯、碳酸根等负离子,也会与蛋白质分子上的电荷相互作用,影响肽链的折叠过程。

有些氨基酸的侧链是不带电的,例如丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的侧链完全由碳原子和氢原子组成,无论是碳原子还是氢原子都不带电。这些侧链无法与水分子之间形成氢键,突进水分子之间又会破坏水分子之间的氢键,在能量上是不利的,所以这些“憎水”的侧链往往被水环境排斥,位于分子的内部,以避开与水分子的接触,形成蛋白质分子的“油性内核”。

所有这些相互作用都会影响肽链的折叠,所以蛋白质分子的折叠是一个极为复杂的过程,肽链可以采取的形状的数量也是天文数字。如果蛋白质分子随机地区尝试所以这些形状,就是亿万年的时间都不够,但是在细胞内,肽链在合成后不到1秒的时间就完成折叠过程,这又是如何实现的呢?

简单来说就是最低能量法则,即将肽链折叠到能量最低,也最稳定的形状。肽链在伸展状态时,许多氢键都没有形成,相当于储存了许多“势能”,像位于高处的石头,很容易向比较低的地方滚动。氢键的形成逐步释放出这些能量,相当于石头逐渐滚下山坡,最后到达位置最低的地方。在蛋白的氨基酸序列里面就包含有信息,折叠从一些局部开始,最后扩展到整个分子。

由于折叠过程的复杂性,走向能量较低状态的路径也许不只一条,相当于山顶上的石头可以从不同的路径滚下山坡,而且还有比较低,但不是最低的地方“等着”它,所以石头不一定能够到达最低的地方。

环境条件的变化,例如温度、酸碱度、盐浓度、其它分子的存在状况等,都可能影响蛋白的折叠过程。许多肽链在合成尚未完成时就开始折叠,由于缺乏整体的信息,由部分肽链折叠成的形状也许是不正确的。

基因突变也可能影响蛋白的折叠。如果基因突变改变了蛋白质分子中和折叠有重要关系的一个或多个氨基酸,就会使蛋白寻求另一种最低能量状态,也就是不能再折叠成正常蛋白的形状了。最著名的例子就是镰刀形红血球贫血症(Sickle-cell anaemia, SCA)。患者血红蛋白β-亚基的基因中发生了突变,一个碱基从A变成了T,使得第六位的谷氨酸残基(由GAG编码)被缬氨酸残基(由GTG编码)取代。由于谷氨酸残基的侧链是带负电的,而缬氨酸残基的侧链是不带电的,这一个电荷的变化就影响了蛋白质分子中电荷相互作用的情形,使得变异的蛋白质形状改变,红血球也从碟形变为镰刀形,而且不能有效地输送氧气。

蛋白在细胞中浓度过高也会引起折叠变化。许多功能蛋白复合物含有多个蛋白亚基,这就要求每个亚基在细胞中生产的数量必须彼此匹配。如果某个亚基生产过多,这个亚基“找不到”复合物中其它的亚基,只能自己单独存在,而这种状态是不稳定的,也会导致异常的折叠状况。

抗体分子由重链和轻链两种蛋白质组成。为了对数量巨大的外来物质产生结合力,抗体蛋白的可变部分(即用于结合外来物质的部分)是由DNA小片段随机组合而成的序列编码的。这种机制能够从有限数量的DNA片段产生数量极为巨大的DNA序列,是生物的“聪明”之处,但是这种机制也有问题,就是有时产生的重链和轻链非常容易转变为Prion型的结构。

即使蛋白分子折叠成为正确的形状,也是容易改变的。氢键的键能一般不超出10千卡/克分子,远低于共价键的近百到几百千卡/克分子,而和室温下分子的动能在一个级别上,因此温度升高会使氢键破裂,即氢键会由于被周围分子的碰撞而被“撞断”,因此随着温度的升高,蛋白质的稳定性也降低。鸡蛋被煮后蛋清凝固变白就是高温使蛋白中的氢键破裂,肽链伸开互相缠绕的缘故,这个过程叫蛋白质的“变性”(denaturation)。

由于这些原因,新合成的肽链中,平均有约30%不能折叠成为正确的形状,已经折叠好的蛋白质分子也有可能变性。为了应付这种情况,细胞发展出了多种机制来减少折叠错误和清除折叠错误的蛋白。

一种机制是细胞发展出的“伴侣蛋白”(chaperones),它们结合在尚未完成的肽链上,防止它们过早折叠,并且帮助它们折叠成为正确的形状。这些蛋白也能够减少温度升高时蛋白质的变性,在细胞遇到热冲击时会增加这些伴侣蛋白的量,所以这些蛋白又叫做“热休克蛋白”(heat-shock protein, hsp),例如hsp70hsp90hsp104等,其中的数字表示这些蛋白的分子量(kDa,即千道尔顿)。

如果蛋白分子已经折叠错误而且不可挽回,唯一的办法就是清除它们。细胞质内是不能有降解蛋白分子的蛋白酶的,不然正常的蛋白分子也会被降解。细胞采取的办法,是将这些异常蛋白质在蛋白体(proteosome)中降解,或者在细胞中的“胃”——溶酶体(lysosome)中降解。

蛋白体是由多个蛋白亚基组成的圆筒形结构,中段的内面有蛋白酶活性,可以把进入筒内的蛋白质(以伸展开的肽链的形式)水解为氨基酸。由于蛋白酶的活性位于圆筒内面,对圆筒外的蛋白质不会有影响。为了只让要被清除的蛋白进入蛋白体,细胞给要销毁的蛋白分子都打上“标签”,这个“标签”也是一种蛋白质分子,由于在各个细胞中广泛存在,叫做“泛素”(ubiquitin)。只有被泛素标记上的蛋白质才能被蛋白体识别并且让其进入。

折叠错误的蛋白常常会彼此结合,聚合成为比较大的“团块”或者纤维状。这些聚集的蛋白即使被打上泛素的标签,也由于它们体积太大而使蛋白体“啃”不动它们。这个时候细胞就会启动另一种功能,那就是“自噬”(autophagy),细胞质内形成半球形的膜,像张开的“嘴”,将一部分细胞内容物,包括蛋白凝聚物,甚至一些细胞器如线粒体,都“吞”进去,形成完全由由膜包裹的“自噬体”(autophagosome),自噬体和溶酶体融合,自噬体中的内容物就进入溶酶体,在那里被消化掉。

如果折叠异常的蛋白在细胞外凝聚,细胞就不容易清除它们了。疯牛病的Prion蛋白和引起老年痴呆症的Ab蛋白(见后文)都是在神经细胞外形成聚合物和斑块的,细胞也不能有效地除去它们,最后导致细胞的死亡。即使是在细胞内,在有的情况下,细胞也无法清除它们。因此即使细胞有多种机制来防止蛋白折叠异常和清除折叠异常的蛋白质,在有些情况下折叠异常的蛋白质还是会出现并且在细胞外或者细胞内留存并且积累,导致疾病。

传染性蛋白的结构特点和传染性的由来

      蛋白分子发生异常折叠后,分子的结构会发生改变,其中最重要的是原来的a-螺旋和无定形的肽链部分转变为b-折叠。例如“正常”的Prion 蛋白(PrPc)中含有大约40%a-螺旋,而几乎没有b-折叠。而引起痒羊病的Prion蛋白(PrPsc)中,却有45%的肽链部分在b-折叠中。

     

不仅如此,PrPsc中的b-折叠还会作为模板,“诱使”PrPc蛋白也形成同样的b-折叠,也就是变成PrPsc的分子结构。换句话说,PrPsc蛋白有以自身为模板,以PrPc为原料,“复制”自己的能力。这正是这种形式的蛋白质具有传染性的原因。即使到了新的动物体内,它也能够把该动物的PrPc改变成为PrPsc,即在新的动物中复制自己。

如果PrPsc复制自己后仍然停留在单分子状态,没有毒性,那最多使得PrPc的数量减少,相当于使PrPc的功能减弱或者消失。但是PrPsc分子并不停留在这一步,而是多个PrPsc分子还会通过分子中的b-折叠一层一层地叠加起来,形成细长的纤维状结构,叫做“小纤维”(fibril),这样的结构就可以具有毒性,导致神经细胞的坏死。用聚合程度不同的PrPsc聚合物来感染豚鼠的大脑,发现含有14-28PrPsc分子的小纤维,即聚合程度还不高的小纤维,毒性最强,但是其杀死神经细胞的机制还不清楚。

用电镜观察这些小纤维,发现它们的直径在10 nm左右,不分支。新的PrPsc分子加在小纤维的顶端,使小纤维不断延长,因此观察到的小纤维长度不一。在小纤维中,b-折叠中肽链的方向是与纤维的长轴相互垂直的,叫“横向”的b-折叠(cross b-sheet),即小纤维是由b-折叠的“片”一层一层地叠加而成的,就像盘子可以叠起来,形成一大摞盘子一样。这样形成的结构极为稳定,不容易被蛋白酶水解,而且能够耐受高温处理,这是食用受疯牛病感染的牛肉,即使经过充分的烹煮或者烧烤,也会被传染上疾病的原因。

这样的结构可以用染料“刚果红”(Congo Red)染成砖红色。在结合到Prion型的肽链结构时,刚果红在可见光范围内的吸收峰会向波长更长的方向移动,从刚果红自身的480 nm变为长于500nm。这个性质可以用来鉴定Prion型的蛋白结构。由于小纤维中b-折叠具有方向性,对偏振光的吸收率随方向而不同,在被刚果红染过的PrPsc蛋白在偏振光显微镜中呈苹果绿色,叫做“双折射”(birefringence)现象,这是鉴定传染性蛋白的另一个特征性指标。还有一种染色办法是用硫黄素TThioflavin TThT)。它在结合到传染性蛋白上后荧光强度会增加,并且发出的荧光峰值有红移现象,即发射光谱的波长变长,从445 nm移到482nm,可以作为另一个鉴定Prion型蛋白的指标。

同样是b-折叠,为什么多数蛋白的b-折叠并不引起蛋白分子的聚集为小纤维,也不引起疾病,而传染性蛋白却能够通过它们的b-折叠聚合成小纤维,引起疾病呢?在刚过去的2017年,德国科学家用冷冻电镜成像技术(cryo-electron microscopy)测定了引起老年痴呆症的Ab纤维的详细结构,找到了问题的答案。在“正常”的蛋白分子中,b-折叠的“片”通常被a-螺旋的“棍”隔开,彼此不能接触,所以“正常”的蛋白分子中没有b-折叠的“片”叠在一起的情形。这些b-折叠的“片”通过它们氨基酸残基的侧链与肽链的其它部分以及溶液中的分子彼此相互作用,保持蛋白分子大致球形的形状。在这样的蛋白分子中,亲脂的侧链位于分子内部,不与外界的水接触,亲水的侧链则位于分子表面,与水“亲密接触”,形成内部是“油性”,外部是“水性”的分子结构,即所谓的“油滴”模型。而在传染性蛋白中,b-折叠“片”的中心部分是亲脂的,即这些部分的许多氨基酸残基的侧链是不带电的,而“片”的周围是亲水的,形成的不是“中心油滴”,而是“中心油片”。由于片内油性的中心不像“油滴”分子那样是被亲水的外部完全包裹,彼此隔绝的,而只是在平面的周围被亲水部分围绕,在上下两面仍然是暴露于水溶液的。这是一种不稳定的状态,再加这样的“中心油片”之间没有a-螺旋“棍”的阻挡,所以这样的“片”能够叠在一起,中心部分通过它们亲脂的侧链相互作用,周围部分通过亲水的侧链相作用,导致“片”的叠加,形成不分支的小纤维。这些小纤维的中心部分是亲脂的,周围则是亲水的,所以不是被亲水部分包裹的“油滴”,而是被亲水部分包裹的“油棍”。这就是比较稳定的结构了。与“油滴”结构是彼此独立的情形不同,这种“片”的叠加是没有终点的,每个肽链形成的“片”都可以无限制地叠加在已经形成的小纤维末端,形成越来越长的纤维。

这样的结构有些像DNA的双螺旋,亲脂的碱基在内部,彼此叠加在一起,亲水的磷酸-核糖键在外部。Ab蛋白形成的小纤维甚至也是“双螺旋”,每一层由两条Ab肽链组成,它们各自形成的一个b-折叠“片”,两片通过离子键对在一起,成为小纤维中的一层,而且整条纤维也呈一定的螺旋结构,但不是a-螺旋,而是更大尺度上的螺旋。

许多蛋白质都含有容易变为b-折叠的肽链部分,如果把这些部分从分子中游离出来(例如引起老年痴呆症的Ab片段从它的前体蛋白APP中游离出来,见后文),除去那些可以形成a-螺旋的肽链部分,并且这样形成的b-折叠片是“中间油性周围水性”的,就可以形成b-折叠片叠加的情形。基因突变也可以改变蛋白分子的折叠方式,在不删除肽链的其余部分的情况下也可以形成可以叠加的b-折叠片。这样形成的小纤维由同样的基本原理形成,但是具体结构却随肽链的不同而不同,沉积的位置不同,引起的疾病也不同,导致一大类蛋白分子因“折叠错误”而引起的疾病,因其都由传染性蛋白形成“淀粉样”的沉积有关,所以统称为“淀粉样变性病”。这将在本文的第二部分中加以介绍。





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