聚焦生物仿制药(4): 生物仿制药的技术门槛到底有多高？

 王守业

           在我的第2篇生物仿制药博文曾经提到生物仿制药一个特点为技术门槛高，我个人认为这个技术门槛高至少表现在两大方面：第一个方面是有关生产、制造过程和工艺流程，在产品生产过程中有多种因素可能会影响到生物仿制药的质量，如分子设计、表达系统、细胞株类型、翻译后修饰(PTM)、不纯物和污染物、配方和辅料、包装容器、生产过程中的蛋白降解等；另外一大方面就是对生物仿制药在质量、安全性和有效性(QSE)等方面进行分析检测、表征，需要在临床试验前在蛋白的多种性质上和原研药参考品一致，这种一致性，根据欧盟EMA的要求需要“相似”（similar）, 而根据美国FDA的要求则需要“高度相似”（highly similar）。出于工作关系和个人兴趣，我就谈谈生物仿制药的分析技术。如文中表格所示，生物仿制药的表征分析，涉及许多生物化学和生物物理技术，我对这些技术都谈不上精通，但是对于大多数技术还算略知一二，本文无意具体谈这些分析技术的细节和难度，而只是想通过评论这些技术手段试图说明进入生物仿制药的门槛很高。

与评价化学药类似，对于生物药的评价，质量、安全性和有效性可以说是最重要的三个方面，而质量又是安全性和有效性的前提和基础。而对于生物药的质量方面，FDA认为治疗性蛋白的三大方面的性质虽然不能被完全充分测定，但是对于评价蛋白药是非常重要的：即PTM、蛋白高级结构和蛋白聚集，下面将分别简单介绍。

蛋白的翻译后修饰(PTM)有很多种，常见的包括糖基化（又可细分为：半乳糖苷基化、岩藻糖基化、唾液酸糖苷化等）、氧化、磷酸化、硫酸化、脂化、二硫键形成和脱酰胺[1]。这些化学变化大多是在细胞内发生的，但是有些也可能发生在生产的各个阶段如纯化和储存过程。现在的科学研究已经表明, 蛋白的PTM会影响蛋白的活性和免疫原性。蛋白的PTM还可能会改变蛋白的结构进而引起聚集，从而进一步影响蛋白的免疫原性。因此，需要对蛋白类药物的生产各个阶段对蛋白质的PTM进行检测。对于含有许多种蛋白质的复杂混合物（如有些预防性疫苗）这类蛋白药物，即使是采用蛋白质组学技术，如果检测所有蛋白的PTM也是一个非常大的挑战。对于单一成分的纯化蛋白药，其PTM的检测和监测则相对容易一些，研究蛋白PTM的最有力的利器当是生物质谱了[主要是基于电喷雾（ESI）和基质辅助激光解离(MALDI)两种技术]。质谱在生物仿制药领域的应用近年来明显增多，今年6月份，在美国Minneapolis召开的第61届美国质谱协会会议上，至少有超过10个口头报告或墙报是直接用质谱研究生物仿制药PTM的，其中糖基化研究占比最大。但是由于生物质谱价格昂贵，动辄就是几十万美元，高端点的，售价基本都在50万美元以上，这也限制了生物质谱在包括生物仿制药在内的生物制药领域的应用。

评估生物仿制药质量、安全性和有效性(QSE)的分析方法

表格主要根据文献[2]制作，有补充和改动。 

蛋白的高级结构是指蛋白的二级、三级和四级结构，这些结构特性决定了蛋白的三维空间结构，也进而最终决定了蛋白的功能和活性。因此，比较生物仿制药（指蛋白药）和原研药的蛋白的高级结构是证明两只药相似的重要手段。X-射线衍射和核磁共振(NMR)是公认的测定蛋白质三维空间结构的两种最主要的技术。但是，对于生物仿制药和原研药的结构相似性研究，这两种技术都有很大的挑战。对于X-射线衍射而言，需要耗时较长的蛋白结晶过程和数据解析过程，对于样品量较大的工业界而言，这显然不能满足高通量的要求。而NMR，不但价格昂贵、灵敏度相对较低、数据分析耗时长，对于分析分子量达150 kDa的大分子抗体药，也面临很大的挑战，所以NMR在生物仿制药领域注定应用非常有限。
    另外，还有一些其它经典生物物理技术被用于表征蛋白的结构，如圆二色性谱、傅里叶变换红外光谱、荧光光谱、差示扫描量热法、分析超速离心、排阻色谱以及各种染料结合鉴别技术等。这些技术一个最主要的限制就是只能检测来自蛋白不同部位某一种总的信号。从这些测定得到的信息只能得到生物药整个结构的总的平均值。比如对于圆二色性谱测定就只能表明某一种主要的二级结构（α螺旋、b折叠和无规卷曲）的平均百分比。如果一个含有多个α螺旋结构的蛋白，其中只有一个α螺旋结构和另一蛋白相比发生了变化，但是即使这一变化相对较大，被另外不变的α螺旋平均以后，圆二色性谱所能测到的变化也可能很小，甚至没有可以测量出的变化。所以这些经典生物物理技术不能用于检测生物药很小的结构变化。而更灵敏的技术则是氢氘交换质谱(HDX-MS), 这也进一步显示质谱技术在比较生物仿制药和原研药结构方面的重要性。现代生物质谱技术在生物药领域的应用已经远不止仅仅只能做蛋白质鉴定、分子量测定、氨基酸序列测定，蛋白结构仅仅是其新的多种应用的一个方面。

    蛋白聚集是蛋白药生产过程中很头疼的问题，尤其是对于高浓度的蛋白溶液，很容易引起蛋白聚集。单体蛋白的聚集过程可以是可逆的、也可能是不可逆的，其聚集后的大小可以从二聚体到包含有上万亿个蛋白单体的、肉眼就可看见的颗粒。总的来说，蛋白聚集，对于任何蛋白药都会是问题。蛋白聚集不但会降低蛋白药的有效剂量，更大的问题是可能会引起毒副作用和免疫反应，在有些特别情况下，这些难以预料的副作用甚至可能是致命的。正由于此，蛋白聚集必须被检测、定量和表征用以比较生物仿制药和原研药。如表中所示，表征蛋白聚集的主要分析技术包括排阻－高效(压)液相色谱(SEX-HPLC)，凝胶电泳，分析超速离心，光散射法。由于简单、易用、廉价、快速、样品用量少等特点，SEX-HPLC是目前检测蛋白聚集的最常用方法。当然SEX-HPLC也有自己的缺点，如较大的蛋白聚体可能在进样上柱时就被除去，造成假阴性。这也进一步说明没有任何一种十全十美的分析技术，正是缘于此，美国FDA建议生物仿制药研发企业不但检测蛋白不同种性质，也建议采用多种技术检测同一种性质，以尽量得到更全面的生物仿制药和原研药可以比较的多种信息(如理化性质、生物活性、免疫化学性质、纯度、不纯物和污染物等)。

      值得一提的是，在生物仿制药有两个常用且易于混淆的概念：可比性(comparability)和相似性(similarity) 。国际人用药注册技术协调会议(ICH), 明确定义和限制可比性是指同一家生产商所生产的原研药（包括批准上市后阶段），在生产工艺变化（如放大）后，两种工艺所生产的同一产品（当然不可能100%相同）的可比性（参见ICH Q5E指导性文件：Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their Manufacturing Process, 生产过程变化后生物工程/生物产品的可比性)。而相似性则是生物仿制药生产商仿制的生物药与原研药生产商制造的参考品相比较而言的。但是，事实上，可比性和相似性这两个概念在生物仿制药领域经常被不加区分的使用。如果根据ICH的定义，可比性概念是不可以用于生物仿制药的。事实上，对于开发生物仿制药的厂商而言，最大的困难显然不是上述两个易混淆的概念，可能一个最大的困难是生物仿制药与原研药的相似度要多高才足够高，目前欧盟EMA和美国FDA已经出台的有关生物仿制药的指导性政策文件都没有明确的界定，而由于生物药的复杂性和其本身的千差万别，也决定无法有明确的界定。所以欧盟EMA和美国FDA的有关文件中时常会出现“case by case”（具体问题具体分析）的字眼。

 主要参考文献

[1]        S.A.Berkowitz, J.R. Engen, J.R. Mazzeo, G.B. Jones, Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and the implications for biosimilars, Nat Rev Drug Discov 11 (2012) 527-540.

[2]        B.S.Sekhon, V. Saluja, Biosimilars: an overview, Biosimilars 1 (2011) 1-11.

后记：本文主要内容2013年10月23日发表于《中国科学报》第8版，标题为：生物仿制药的技术门槛有多高，本博文为原文，发表后有较多删改。本系列博文，未完待续，敬请继续关注。