病毒与受体的结合是病毒进入细胞完成自身复制增殖的第一步，病毒受体的发现对病毒感染细胞和动物模型的建立有重要意义，这些模型的建立对研究病毒的复制和致病机制，以及抗病毒药物的开发具有重要的意义，同时病毒受体本身也是设计抗病毒药物的重要靶点。因此发现病毒受体的工作是一个很重要的工作，一般病毒受体的发现的工作做得好的话都能在Nature、Science等超一流刊物上发表，比如HIV，HCV，CMV，Influenza virus等。

HIV的受体部分文章:

1、  Wu, L., N. P. Gerard, R. Wyatt, H. Choe, C. Parolin, N. Ruffing, A. Borsetti, A. A. Cardoso, E. Desjardin, W. Newman, C. Gerard, and J. Sodroski. 1996. CD4-induced interaction of primary HIV-1 gp120 glycoproteins with the chemokine receptor CCR-5. Nature 384:179-83.

2、  Feng, Y., C. C. Broder, P. E. Kennedy, and E. A. Berger. 1996. HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven-transmembrane, G protein-coupled receptor. Science 272:872-7.

3、  Choe, H., M. Farzan, Y. Sun, N. Sullivan, B. Rollins, P. D. Ponath, L. Wu, C. R. Mackay, G. LaRosa, W. Newman, N. Gerard, C. Gerard, and J. Sodroski. 1996. The beta-chemokine receptors CCR3 and CCR5 facilitate infection by primary HIV-1 isolates. Cell 85:1135-48.

4、  Doranz, B. J., J. Rucker, Y. Yi, R. J. Smyth, M. Samson, S. C. Peiper, M. Parmentier, R. G. Collman, and R. W. Doms. 1996. A dual-tropic primary HIV-1 isolate that uses fusin and the beta-chemokine receptors CKR-5, CKR-3, and CKR-2b as fusion cofactors. Cell 85:1149-58.

5、  Alkhatib, G., C. Combadiere, C. C. Broder, Y. Feng, P. E. Kennedy, P. M. Murphy, and E. A. Berger. 1996. CC CKR5: a RANTES, MIP-1alpha, MIP-1beta receptor as a fusion cofactor for macrophage-tropic HIV-1. Science 272:1955-8.

按理作为HBV的第一个“functional receptor”无疑是可以在这种级别的文章上发表的，但是为什么只是在eLIFE这种新杂志上发表呢？当然本人丝毫不怀疑这个杂志的日后影响力，也知道好的工作其实最终和发表在什么级别的文章上好像关系不太大，能发表在主流的权威刊物上就可以了。但是国内现在讲究文章影响因子，相信现在谁都想往高的发，虽说高的并不一定比低的好。我们组一位年轻老师的工作做得非常好、很基础，发的文章都是在基础的权威刊物上，影响因子不高，单篇没有过10的，但是在我看来远比一些高影响因子的刊物上的文章比如Hepatology，Gut等要出色很多，但是就在今天学院的副教授的公示名单上没有他的名字。这是题外话。

言归正传。这个工作有不少巧妙的设计，比如利用了一种近零距离光交联技术（near zero distance photo-cross-linking），这应该是他们能找到NTCP的关键所在，其他方法比如GST pulldown，Co-IP，yeast two-hybrid，噬菌体展示，蛋白质组找差异蛋白的方法被很多科学家采用，但是都得到了一大堆数据，最后真假难辨。利用树鼩肝细胞，解决了肝细胞来源问题，以前很多人就用一些肝癌细胞比如HepG2来做明显是不明智的。用好了HDV这个天然的HBV假病毒模型，虽然有一定的争议。

从结果来讲，HBV preS1与NTCP的结合做得很扎实，这个没有什么多说的。但是在NTCP介导HBV进入细胞的机制方面和在病毒复制方面不是很明确。分述如下，不分先后。

1. HBV以multiplicities of genome equivalents（mge）of 100感染NTCP稳定转染的HepG2细胞后大约只有不到10%的细胞感染。注意100的mge是很高的病毒量了，一般的病毒MOI为个位数就很高了。重要的是HepG2细胞本身就能完整地支持HBV生活周期post-entry的所有步骤，比如把HBV的基因组转染入HepG2细胞后是能产生很强的复制的，一般上清都能检测到10的5到6次方左右的病毒量。虽然作者一直在NTCP稳定转染的HepG2细胞和原代肝细胞之间比较感染效率，但是原代肝细胞即便用腺病毒HBV(Ad-HBV)去感染复制也是低的。另外，NTCP其实在HepG2细胞上表达并不低，还是有一定的蛋白表达的。因此NTCP介导HBV进入HepG2细胞的能力是很弱的。这应该是这个工作的硬伤，无论你的课题起点有多高，但是如果结果不足够显著还是不行的，这取决于运气。当然他们已经足够幸运了。

2. 虽然一些针对preS1的抑制剂和单克隆抗体能抑制HBV/HDV的感染，但是NTCP的中和抗体能否阻断HBV/HDV的感染没有数据，这应该是一个问题的两个方面。因为preS1的抑制剂和单克隆抗体能抑制HBV/HDV的感染也可能是抑制了和其他未知受体的结合而非NTCP。

3. NTCP是介导病毒的吸附（attachment）还是进入（entry）文章中没有阐述。我想这是一个关键的问题。只是笼统地得出NTCP是一个functional receptor是不够的。这个实验其实很容易做。利用4°C条件下HBV只能吸附而不能进入细胞就可以区分。好像这个实验也要用到NTCP的中和抗体才行。

4. NTCP在HBV进入细胞过程中到底有多重要没有完全阐明。虽然NTCP能使部分支持HBV复制的HepG2细胞变成完全支持HBV复制的细胞（虽然有一定的差别），但是能使完全不怎么支持HBV复制的非肝细胞比如HeLa，293T变成支持HBV进入的细胞吗？如果行那说明NTCP是独一无二的，如果不行那就还有一些co-receptor。总之需要阐明，不能模糊。

5. 文章没有完全排除NTCP在HBV进入细胞后也起作用，比如DNA的复制，病毒的装配和释放，甚至RNA的转录等环节。虽然作者在AAV8-HBV系统中通过检测HBV的HBeAg来阐明这个问题，但是这是很不够的。作者检测到的一些病毒RNA和复制中间体的升高或者降低可能是NTCP对这些环节的直接作用，说不清楚。

6. 文章中在检测HBV复制的时候主要用的都是一些间接的方法，比如ELISA，IF，qPCR。这是很不够的。HBV的RNA必须要利用Northern botting来检测，不能只是qPCR，病毒的复制中间体DNA必须要利用Southern blotting来检测，也不能只是qPCR。因为HBV的RNA和复制中间体DNA有几种或者几种形式，用qPCR笼统地去检测是不太科学的，尤其对于这么重要的科学问题。

7. 文章用ELISA检测了HBV的HBsAg和HBeAg，最好同时检测core蛋白。因为病毒感染的时候带了很多外来的HBsAg和HBeAg。虽然做了时间动力学曲线，但是说不清楚。

8. 文章中用Southern blotting检测到了cccDNA的形成。cccDNA是HBV转录的膜板，被认为是HBV持续感染的关键因素。从结果来看cccDNA的形成时间与HBV蛋白、RNA和DNA相比比较早，尤其量很高。其实对于HBV来说哪怕是CMV启动的HBV（比如pCMV-HBV）cccDNA的量都是很低的，更不要说是自身启动子启动的了。在NTCP介导的HBV复制水平整体很低的情况下，具有高水平的cccDNA形成，让人怀疑作者检测到的cccDNA是否是真的cccDNA，所以作者必须证明他们所指示的条带是真的是cccDNA，必须用EcoRI酶切（cccDNA能被EcoRI线性化）和加热煮沸cccDNA（沸腾后不会被解成单链）来确证，同时必须要有阳性对照。当然对于鸭乙肝病毒（DHBV）来说cccDNA比较高，所以研究cccDNA的人比较喜欢用DHBV来研究。

9. 细胞中NTCP的表达只是检测了其mRNA水平，必须用流式细胞仪检测其蛋白在细胞膜表面的表达情况。

10. NTCP的 siRNA实验没有用siRNA resistant NTCP做回复实验，有可能其现象是脱靶效应造成。

11. 如果这个工作能和做HBV复制比较厉害的实验室合作的话，可能会有所改善。

不管怎么样这都是一个很好的工作，并且据说结果已经被一些实验室重复出来了，我也正在重复了，呵呵。这个工作无疑给暮气沉沉的HBV研究添加了新的动力。虽然我提出了这些问题，但是我只是从学习的角度来谈一下我的看法，丝毫没有其他意思。相反对他们五年如一年的科学态度和科学精神特别钦佩，所以希望我的博文不要引起大家的误会。我自己最近一篇文章已经被拒过四次了，现在还在努力，深知要在超一流刊物上发表论文谈何容易。由于自己水平和时间有限，我的观点估计很多是错的和不全的，大家看看就好了。

但愿困扰中国人的乙肝问题能被中国人自己解决，靠老外是没有用了，老外不怎么做HBV了，同志们努力吧！