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177从免疫学角度解读狂犬病

已有 786 次阅读 2017-10-9 19:56 |个人分类:狂犬病基础|系统分类:科普集锦

从免疫学角度解读狂犬病

   狂犬病是一类由嗜神经性病毒——狂犬病病毒(RABV)引起的致死性疾病,该病目前在全球范围内仍然是一个重要的公共卫生问题。众所周知,宿主的免疫应答在调控病毒的侵染和促进病毒的清除方面发挥着重要作用。关于这点,有研究表明除了RABV诱导产生的中和抗体之外,干扰素和细胞介导的免疫在预防疾病形成方面同样扮演着重要角色。另一方面,RABV可以通过不同的机制来抑制宿主的免疫反应,例如:直接抑制宿主的基因表达、隔离病原相关分子模式或者修饰细胞因子信号途径,这些均能防碍宿主对抗RABV入侵的保护性免疫反应。在本文中,我们回顾了狂犬病免疫学相关文献,重点阐述了先天免疫和适应性免疫,以及病毒利用宿主体内的逃避免疫机制。最后,我们简要讨论了一下如何利用这些知识直接指导新研究和制定未来的治疗策略。

前言

   狂犬病是由狂犬病病毒(RABV)引起的一种急性脑炎,其在分类学地位上从属于弹状病毒科狂犬病病毒属狂犬病病毒种[1]。它是一类最重要的人畜共患病,可影响哺乳动物的中枢神经系统(CNS),尤其是在此类动物的某些目中。绝大多数的人类病例发生在非洲和亚洲,狗是该病的主要传播宿主,全球每年超过6万人因为罹患该病而死亡。

   狂犬病病毒的基因组为负链RNA,其长度约12 kb,编码5个结构蛋白,依次为:核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和依赖RNARNA聚合酶(L)PLN蛋白参与形成螺旋状的核糖核蛋白(RNP)复合体,并且在病毒复制、转录和诱导宿主细胞及体液免疫应答方面发挥关键作用。RNP复合体由一层包含M蛋白和跨膜G蛋白的病毒包膜所环绕。G蛋白位于狂犬病病毒粒子表面,能够诱导宿主产生抗RABV的中和抗体(VNA)。此外,它还在狂犬病病毒发病过程中发挥重要作用,通过与细胞内受体(主要是乙酰胆碱受体(nAChR))互作来行使功能。

   一般而言,RABV通过咬伤或抓伤宿主来传播病毒。肌内感染RABV后,病毒在肌肉组织中经历一个时长可变的低水平复制阶段。然而,当接种高滴度RABV时,病毒可感染运动终板,且不需要在肌肉中起始低速率复制。不过,也有其他研究显示病毒在肌肉组织中的复制对于其神经侵染性而言是必需的,且取决于病毒株系特异性和病毒逃脱宿主免疫的能力。

   感染宿主后,RABV通过与nAChR及神经细胞粘附分子结合来穿过神经肌肉接头,经逆行轴突运输通路(图1)扩散到CNS。然而,有文献报道,接种于足底足垫的RABV可被大感觉神经元优先捕获,运输到背根神经节,然后上行至大脑。另一研究表明RABV能够将树突细胞(DCs)作为交通工具将自身传至外周神经细胞,在此复制并扩散至CNS。这种偏好于某一种或其他类型的途径可能取决于病毒接种位点、感染后时间、病毒载量和咬伤深度。

   RABV到达中枢神经系统后,该病的临床症状才会表现出来。在中枢神经系统内,RABV导致神经功能障碍,引起死亡。如果宿主能够存活足够长时间,病毒粒子可离心式地传播到自主神经系统和周边腺体中(如唾液腺、肾上腺和泪腺)。因此,病毒可通过与被感染动物唾液接触的方式侵染其他哺乳动物

   RABV经过神经迁移至中枢神经系统的过程中,病毒可被先天免疫系统所识别。不过,只有当病毒感染中枢神经系统时,RABV的特异性免疫应答才会被触发。简而言之,先天免疫系统组成了宿主防卫病毒感染的第一道屏障,在早期识别和随后微生物入侵激活的炎症反应中扮演重要作用。此外,在侵染晚期,适应性免疫系统负责病原物的清除和免疫记忆的形成工作。因此,在RABV侵染后,随着病原物的清除,宿主保护性免疫应答得以激活,不过,宿主免疫可能也在病毒发病过程中起到作用。

   本篇综述基于免疫接种后及实验动物模型基础,总结了现今已有的与狂犬病免疫及病毒用以规避宿主免疫系统的逃脱机制的相关知识。在文章结尾处,我们探讨了狂犬病免疫研究的进一步动向,并对现有知识能否为狂犬病治疗新方案的发展扫清障碍这一问题展开了讨论。

对抗RABV的先天免疫系统

   先天免疫系统能够通过种系模式识别受体(PRRs)来检测微生物的存在与否。PRRs通常用来鉴定进化的保守结构,如病原物相关分子模式(PAMPs)和危险相关分子模式(DAMPs)等。在PRRs中,研究透彻的家族主要有Toll样受体(TLRs)、视黄酸诱导基因I型受体(RLRs,如视黄酸诱导基因I (RIG-I)和黑色素瘤分化相关基因5 (MDA5))、热蛋白、HIN结构域(PYHIN)蛋白(如AIM2)和核苷酸结合寡聚结构域(NOD)样受体(如NOD1NOD2NLRP1NLRP3NLRC4)等。病毒元件的识别会导致信号转导通路被打开,释放出I型干扰素(IFN α/β)、炎性细胞因子和趋化因子,将免疫细胞吸引至被感染组织中。

   在病毒侵染早期,宿主先天免疫系统识别病毒后,其防卫反应会被触发。对于RABV而言,病毒通过叮咬或抓挠的方式感染宿主的皮肤或肌肉之后,宿主先天免疫应答即刻被触发。在RABV侵染时,PRRs可能在外周及随后的中枢神经系统中被激活。位于这些部位的RIG-I可识别细胞质中RABV RNA,并将此视为一种特异性信号,经IPS-I/MAVS/VISA/Cardif途径激活细胞核内因子NF-κBI型干扰素调控应答。同样地,在RABV侵染时,TLR-347可被激活,这表明在IFN分泌的过程中,除了病毒基因组RNA外,其他组分可能也有参与。

   起初,神经元和肌肉细胞被认为是RABV的主要靶标,但现今已有证据表明巨噬细胞也可被病毒感染,一旦巨噬细胞转移到体内,病毒也随之传播。病毒被巨噬细胞识别后,可选择性触发ERK1/2信号通路来产生NOCXCL10(非p38),进而调节抗病毒细胞的功能且不会引发过度炎症反应。最近,Lythe等发现巨噬细胞在狂犬病免疫部位发生积累,这种情况要么与皮肤及肌肉组织的巨噬细胞增殖有关,要么与循环性单核细胞的招募有关。招募过程是通过CCR2CX3CR1(不规则趋化因子受体1)感知被感染或损坏组织释放的趋化因子得以实现的。作者强调,这些病毒种群图谱的特征和命运能够为RABV可由感染的巨噬细胞传播这一观点提供新视野。

   显而易见,巨噬细胞除了其他功能之外,还可通过内吞和吞噬作用将病原物吸收到细胞内隔间。DCs是抗原呈递细胞,其对初生T细胞的激活至关重要,并能直接激活宿主产生针对入侵微生物的适应性免疫应答。有报道指出,实验室条件下的减毒RABV感染可大幅度促进NF-κB的激活和DCs的成熟。此外,RABV通过RIG-I信号通路激活DCs,识别病毒RNA,尤其是前导RNA(IPS依赖型),进而诱导产生I型干扰素。相反,野生型RABV不能有效诱导DC的激活,这会对病毒蛋白呈递至初生T细胞的过程产生干扰。作者发现RABV街毒株可通过与DCs低效结合或进入DCs来逃避DC-介导的免疫激活,导致前导RNA的从头合成水平显著下降。这种RABV的无效结合或进入DC的现象与G蛋白有关。最近针对DC的激活分析表明,与携带胞外域的病毒不同,当病毒含有来源于野生型RABV G蛋白的信号肽和跨膜结构域时,有助于病毒与DCs的结合及激活,这暗示着G蛋白介导的DC激活可能由胞外域调控

   众所周知,NK细胞在应对病毒侵染的先天免疫中充当调解员作用。它能识别并杀死病毒感染的细胞,直接或间接通过细胞因子(特别是IFN-γ or IFNα/β)来抑制病毒的复制。部分研究指明,NK细胞在人狂犬病病毒和实验模型中的保护作用发生在适应性免疫反应诱导之前。最近,Horowitz等利用灭活狂犬病病毒证实NK细胞在疫苗特异性细胞因子和细胞毒素的即时招募应答方面起着主要作用,细胞毒素的招募主要依赖IL-2,它由抗原特异性的记忆T细胞产生。值得一提的是,这个研究首次阐明了NK细胞的接种后激活机制,并将关注点聚集到评估NK细胞在接种策略中的效应因子应答反应上。

   病毒一旦到达CNS组织,即可在神经元、星形胶质细胞和小神经胶质细胞中诱发一种由RIG-I介导的反应。该反应可激发一个经典的初级IFN应答(激活IRF3NF-κB和次级IFN应答(激活STATsIRF7),从而导致细胞因子(IL-6, TNF-α,IL-12 and IL-5)的产生。近期,Miao等指出与野生型病毒相比,减毒RABVIFN活性的拮抗作用更加强烈,这暗示着病毒的IFN拮抗活性与其致病性之间并不存在正相关。

   感染后,NLRP3炎症小体可识别RABV,激活IL-1β并使其释放到小鼠树突细胞中。IL-1β在鼠脑中生成后,可在炎症细胞的招募过程中起到促进作用。因此,当缺乏IL-1受体时,病毒致病力会增强,这表明IL-1β参与调控病毒在CNS中的传播。

   同时,趋化因子的分泌能触发直接的抗病毒反应和(或者)将炎症细胞招募至侵染点,从而杀死病毒或被病毒感染的细胞RABV感染时,神经元、星形胶质细胞和小神经胶质细胞之间的相互作用可能参与趋化因子的上调表达。研究表明,与野生型RABV相比,感染了减毒RABV的鼠脑含有显著高水平表达的趋化因子。趋化因子包括CXCL10CXCL1CCL11CCL5CCL4CCL3CCL2。感染CVS-11和感染弱毒(HEP-Flury)相比,在侵染晚期,除CCL22CXCR3CXCR6CCR7之外,趋化因子(除了CXCL10以外)和受体的表达呈现明显上调趋势。

   CXCL10是一类最早发现的弱毒感染后表达的趋化因子(感染4天后),表明它在抵抗RABV病毒感染初期会起到积极作用。在感染了减毒RABV的鼠脑悬浮液中,CXCL10首先在神经元中表达,然后依次为小神经胶质细胞和星形胶质细胞。当免疫细胞从外周迁移至中枢神经系统时,也可产生该趋化因子,参与RABV的清除。

   有意思的是,Appolinário等评估了一系列细胞因子和趋化因子的基因表达情况(如IFN-γCXCL10TNF-αCCL2)。研究表明,在接种了两种野生型RABV毒株的鼠脑中,这些因子与宿主免疫应答有关。作者在文中总结道,快速生成的细胞因子和趋化因子的表达水平在重要性方面远不及其在狂犬病病毒存活方面的贡献。这个现象常见于濒死动物中,尽管它们体内存在高水平表达的细胞因子和趋化因子,但还是要忍受疾病的折磨。

   细胞因子和趋化因子都能导致主要组织相容性复合体(MHC,由小神经胶质细胞调控)的表达水平上调,同时还能提高粘附分子(可促进血脑屏障(BBB)的开放)的表达。BBB由一个复杂的内皮细胞网格组成,内皮细胞由紧密接头(TJ)蛋白相互连接,后者成员主要为闭合蛋白claudinsoccludin和闭锁小带-1、周皮细胞、星形胶质细胞终纽等。网格结构的形成便于选择性运输分子进入中枢神经系统。因此,免疫应答可能会对宿主造成损害,这主要取决于活性氧类释放的数量。

   研究证实,绝大部分由小神经胶质细胞和NK细胞产生的NO分子具有一种潜在功能,从小鼠模型结果可以看出,NO能够调控RABV感染时宿主的免疫反应。RABV感染的鼠脑中的NO可与超氧化物反应,生成过氧硝酸盐,促使脂类发生过氧化,从而破坏血脑屏障。最近,Madhul等研究显示,当用RABV病毒标准株CVS感染时,由于NO含量增加,导致血液和脾脏中的NKCD4CD8 T细胞数量下降。相反,用CVS-AG(一氧化氮诱导合成酶抑制子)处理过的组合呈现更低浓度的NO和更高水平的NKCD4CD8 T细胞。有趣的是,这些处于血液和脾脏部位的增长的免疫细胞与观察到的宿主存活期延长、临床症状发展推迟、病毒载量下降和凋亡细胞减少这些现象相一致。

   中枢神经系统中的常驻细胞和渗透性免疫细胞识别RABV后,可能导致一个化学引诱性环境的形成,诱导感染细胞产生炎症反应。因此,急性炎症不仅与病毒的存在及清除有关系,还普遍与组织破损有关。此外,炎症通常是免疫细胞进入CNS组织的一个关键元素,因为它能改变血脑屏障中的环境,后者的功能是限制免疫系统中的循环性成分与神经组织的相互作用。

   有意思的是,RABV弱毒株诱导与干扰素信号途径相关的主要炎症趋化因子和细胞因子表达,而野生型RABV并不能或鲜少能激活炎症反应。因此,与感染了野生型RABV的小鼠相比,感染减毒RABV的小鼠血脑屏障(BBB)渗透性增强。后来,Chai等报道指出,感染减毒RABV的小鼠BBB渗透性之所以增强,是与TJ蛋白的含量下降有关,例如claudin-5occludinzonula occludens-1蛋白。

   尽管不同RABV株触发和逃避宿主免疫应答的相关机制还未解析透彻,小鼠研究证实神经毒性RABV病毒株通过抑制LGP-2RIG-I样受体,其表达仅限于神经细胞)信号途径来降低鼠脑中的炎症反应。这些研究成果暗示RABV可能利用宿主的先天免疫反应来有效入侵CNSRABV侵染过程中,有限的炎症除了可以维持宿主生命,还能维持被感染的CNS的完整性。这使得病毒能在宿主夭折之前到达脑干和唾液腺区域。

   鉴于以上观点,在触发一次适当的对抗RABV的免疫反应时,有几件事情是至关重要的,比如说免疫效应细胞从外周渗入到侵染点和由CNS驻留细胞引发的BBB的渗透压调整,前者取决于趋化因子和细胞因子的产生。

对抗RABV的适应性免疫应答

细胞免疫应答

   细胞免疫对于宿主抵抗RABV侵染的有效性而言至关重要。尽管特异性先天免疫岗哨细胞(如脑膜和血管周脉络丛巨噬细胞)位于CNS中,外围免疫细胞的招募工作对局部炎症反应十分重要。在CNS中,它们不仅参与病原物的容纳或清除工作,还与宿主的组织损伤有关。

   适应性免疫应答的起始取决于APCs将抗原呈递给初生T细胞,并使其激活。被激活的T细胞位于淋巴结和外周血中,可以表达CD69,此外还能表达高水平的诸如超晚期抗原-4(VLA-4)和白细胞功能相关抗原-1(LFA-1)之类的分子,它们能够促进T细胞在BBB中的迁移。然而,在感染了RABV的小鼠体内,这些激活的T淋巴细胞的极化和招募至CNS的过程是通过折叠响应中介蛋白2(CRMP2)来介导的。CRMP2是一个磷蛋白,在神经元的部分细胞进程中发挥作用。高水平的CRMP2赋予T淋巴细胞更高的能动性。CNS中,一旦遇到此处呈递病毒蛋白的APCs时,RABV特异性T细胞会再次被激活。这些结果表明,在病毒进入CNS后,适应性免疫反应被位于外周的RABV病毒株激活,且与RABV致病性没有太大关系。

   一旦T细胞对某个抗原敏感,它们会与之抗争直至将该抗原清除掉。然而,当高致病RABV株感染时,外围T细胞被激活,并且不会作为一个效应因子。致病性RABV株感染几天后,CNS中的T细胞经凋亡作用而被摧毁,导致致命性脑炎感染过程中淋巴细胞介导的反应被削弱。这些数据暗示着T淋巴细胞在调控RABVCNS组织中的复制方面具有保护作用,至少在某种程度上可以通过渗透的T细胞来产生IFN-γ。然而,它们调控RABV感染的能力会受到脑炎RABV株的负面影响。

   在抵抗病毒侵染的细胞免疫应答过程中,趋化因子和细胞因子的作用十分显著。举例来说,当CNS被感染时,CXCL10能够招募免疫细胞,因为其受体CXCR3在被激活的CD4CD8 T细胞中均可表达。此外,在减毒RABV感染过程中,IFN-γ能够诱导产生CXCL10,从而提高迁移至CNS中的CXCR3+ CD4T 细胞数量。重要的是,CXCL10能帮助T辅助细胞分化形成Th17Th1细胞,二者分别产生IL-17IFN-γ

   一旦Th1免疫应答在弱毒RABV侵染过程中被诱导,T细胞开始进入侵染点,生成IFN-γ,宿主可进一步调控病毒的复制。在病毒中和抗体出现之前,Th1免疫应答能够提高IIFN和其他类型先天性抗病毒机制的诱导表达事实上,由于I型和IIIFN之间存在交叉影响,IFN-γ能够通过诱导和(或)增强IIFN的活性来放大其抗病毒效应。而且,Th1细胞可分泌IFN-γIL-2来帮助被激活的CD8 T细胞的克隆扩增,同样也能诱导抗体在B细胞中发生类别转换。

   有趣的是,由Th17细胞产生的IL-17位于CNS中,其被报道在TJ蛋白变换和由此引起的BBB损坏方面起着关键作用。随后有报道指出,与感染野生型RABV的小鼠相比,感染了实验室级别的减毒RABV株的小鼠脑内含有高表达的IL-17蛋白,它能够起始TJ蛋白的转换过程。

   此外,激活的CD4 T细胞作为初生B细胞和CD8 T细胞的辅助细胞,能够在应答抗原刺激时促进该类细胞的增殖。Phares等人也暗示过浸润的CD4 T细胞对于提高神经性感染应答中的BBB渗透性是必需的,然而CD8 T细胞和B细胞对于BBB渗透性提高而言并不是必要的。

   尽管GNP蛋白是细胞毒性T应答的诱导因子,CD8 T细胞在RABV感染过程中所起的保护性作用还未彻底被人们所了解。起初,有报道提及RABV能够在缺乏功能性CD8 T细胞的情况下将CNS中的RABV清除干净,这预示着CD8 T细胞在减毒RABV的清除方面并不是必需的。另一方面,Lafon等人证实CD8 T细胞可与抗体一起提升IFN-γ的产生来调控病毒的感染,从而在RABV的清除中发挥作用。而且,CD8 T细胞能够诱导神经元发生凋亡,形成一种免疫病理性反应,该反应在临床上与瘫痪有关

体液免疫反应

   体液免疫反应依赖于由被激活的B细胞分泌的抗体。一旦病毒特异性抗体被分泌出来,宿主即可通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或互补依赖性裂解这两个过程,在游离病毒及有病毒感染细胞的消除方面发挥重要作用。因此,部分研究表明,在缺乏显著性细胞破损的情况下,抗体可能通过不同机制将病毒从被感染的细胞中清除干净。然而,狂犬特异性抗体是如何中和掉病毒的过程还有待深入研究。

   研究证实,与其他病毒感染相比,完整的IgG分子在中和RABV方面比特异性F(ab)2区段更有效。这暗示着抗体的体内保护效应高度依赖于IgGFc结构域与其效应子免疫细胞表面表达的同源受体(FcγR)的相互作用。然而,有证据显示可变抗体区段在体外和动物模型中均具备有效的RABV中和活性。

   绝大多数的狂犬体液反应与RABV G蛋白上的表位直接相关,尽管部分抗体可以特异性识别N蛋白。因此,依据接种中和后试验性狂犬模型,我们可以得出以下结论,即在对抗RABV糖蛋白时,只有病毒IgG中和抗体(而不是IgM)可以起到保护性作用。

   IgM在消除RABV过程中的作用有限,主要是因为其五聚体结构偏大,这阻碍了IgM渗透到组织中。然而,就PEP(暴露后预防)而言,快速的B细胞应答对该保护过程是必需的。IgM抗体可能也在该过程中发挥重要作用,它能阻止致病性RABV从外周部位扩散到CNS,而高亲和力IgG抗体主要形成于生发中心。这项研究预示着独立的抗体反应可能在减毒RABV感染形成的早期保护中发挥作用。而且,IL-21已被证实其在减毒RABV活疫苗诱发的快速初级抗体反应中起到关键作用。

   抗体介导的免疫在抵抗RABV感染的病毒清除过程中扮演重要角色,因为动物在野生型RABV感染后不会形成VNAs另外,减毒RABV诱导的VNAs可以与炎症细胞因子合作,一起将病毒清除干净。这表明在宿主保护性反应中,除了抗体,其他免疫元件也很重要。基于以上数据,一些研究发现先天免疫反应特异性分子也会参与狂犬的体液免疫过程。例如,重组RABV可表达细胞因子(IL-6, IL-21,GM-CSF)、趋化因子(CXCL 13, CCL3,MDC)或者细胞内黏着分子1 (ICAM-1),这些分子能够促进免疫细胞激活或招募至引流淋巴结和外周血,这些细胞包括CDsTB细胞。当宿主面临致命的RABV威胁时,上述细胞能使宿主生成更大数量的VPN、使细胞免疫得到增强,从而给宿主带来更好的保护。然而,目前免疫记忆相关机制还鲜为人知,在接种狂犬疫苗后,免疫记忆能够延长宿主的体液免疫。最近,Li等人提出一个观点,过量表达IL-7能够提高记忆B细胞和长寿浆细胞的诱导水平,后者在RABV免疫接种后可以维持一个持久的初级和次级抗体反应。

   自从20世纪60年代中期B细胞首次被发现以来,其产生抗体的能力已被人们熟知。不过,当RABV减毒活疫苗在体外感染初生小鼠及人的B细胞时,宿主呈现出一种抗原呈递表型,从而能以一种抗原特异性和依赖MHC-II的方式来引发及激活初生的CD4 T细胞。这些数据首次揭示了B细胞可以作为初生T细胞的APCs但是,作者同时也提出了质疑,即被B细胞引发的CD4 T细胞在功能性(细胞因子谱)上与其他APCs相比是否具有差异。显然,对于该研究而言,学者还应该进行体内相关研究。这项研究显示B细胞可能在RABV感染的宿主免疫系统激活方面扮演着重要角色。

   有些报道称B细胞也能被其他感染RABV的细胞所激活。例如,Lytle等人证实淋巴结中(非接种部位)的巨噬细胞会在RABV疫苗免疫应答早期行使功能。这可能与B细胞的选择性激活有关,同时也是因为在高浓度抗原条件下,抗体的生成机制方可奏效。这意味着巨噬细胞在RABV疫苗诱导的免疫中存在剂量依赖型需求。最近,用减毒RABV感染时,能够诱导DC的分化和成熟,进而刺激B细胞的激活和VNA形成。这些数据暗含着B细胞在感染或接种疫苗时可能会通过与其他免疫细胞(如树突细胞或巨噬细胞)互作来接触抗原,从而激活初生B细胞。这种在被感染和未感染细胞之间存在的交流和炎症介质的释放或许在疾病形成过程中发挥重要作用。

   然而,目前尚不清楚RABV或者RABV抗原是如何从接种点迁移至局部引流淋巴结,最终到达这些局部结节中的B细胞小囊。APCs(如巨噬细胞)可能充当哨兵的角色,通过传入淋巴结来吸收流入的抗原;在某些情况下,它们可使这些抗原在B细胞下方来回穿梭,并以病毒和病毒样颗粒的形式呈递完整的病毒抗原,来激活卵泡B细胞。

   当谈及体液免疫时,CD4 T细胞的参与是不可否认的。T卵泡辅助细胞(Tfh细胞)B细胞提供生长和选择信号,并推动它们分化成高亲和力、长寿的浆细胞和记忆B细胞。然而,T细胞依赖性B细胞的分化也可以发生在生发中心外,产生浆细胞,在早期保护宿主抵抗感染性病原方面发挥重要作用,但鲜为人知的是生理性生发中心外的抗体反应过程是否也需要该细胞的参与。Haley等人证实表达BAFFRABV重组疫苗可以激活其靶标的生发中心外B细胞应答,从而提高RABV接触后预防的速度和级别。

   尽管CD4 T细胞和B细胞在CNS中互作的本质还不清晰,但可以肯定的是Th1细胞参与了B细胞生成RABV特异性抗体这个过程。其他研究已经证实在应答细胞因子(IFN-γIL-27)BCR刺激的反应时,B细胞可以上调EST1STAT-1基因的表达。其中,EST1STAT-1作为辅助因子,能够上调T-bet(一种Th1-特异性转录因子)的表达,还可诱导抗体类型朝着IgG2a转变。当T-bet基因敲除突变体小鼠感染减毒RABV后,其可通过产生IgG1IgG2b抗体而存活下来。基于此,作者认为减毒RABVCNS中的清除是由于其诱导生成了任何一种特定的同型抗,这个观点是不太可能的。该研究表明,当野生型RABV到达CNS后,即使Th2反应强度很高,也不能确保宿主能够存活下去。不过,正常动物体内的类似反应的确能够阻止病毒从外围扩散至CNS出现上述现象最可能的原因是Th2细胞在CNS中(而非外周)不能为B细胞提供帮助。

   有趣的是,CNS中病毒载量的动态变化与血清中的VNA水平有关。在减毒RABV感染早期,可以观察到最小量VNA的产生,这是因为先天免疫能够调控病毒的复制。感染5天后,减毒RABV感染的小鼠呈现VNA产量提高的症状,这有助于病毒的消灭。在人狂犬病例中,在出现临床症状和体征几天后,抗体应答水平才能被检测到。一般来说,晚期血清转化发生在疾病形成阶段,脑脊髓液(CSF)中病毒滴度低,并且处于一个相对快速的稳定时期。不过,在大多数情况下,病人之所以会死亡,是因为病毒复制位点无法检测到相应的保护性抗体。可以肯定的是,初始RABV特异性免疫应答的缺失,不是由于病毒介导的免疫抑制现象所导致的,而是因为在野生型RABV感染早期,免疫系统缺乏一个监测RABV G蛋白机制。

   就参与RABV清除的抗体起源而言,渗透B细胞生成的RABV特异性抗体对于病毒的消灭至关重要,而该抗体在循回抗体泄漏过程中的作用截然相反。这些现象暗示着外围的VNA不能穿透BBB进入到CNS。其他研究显示,野生型RABV感染后,VNA的外源性管理对病毒从大脑的清除十分重要,也可阻止狂犬病病毒在免疫活性及免疫缺陷型小鼠中的传播,只要BBB的渗透性持续增强。

   在应对RABV感染时,人们对大脑内B淋巴细胞渗透性和持久性相关知识还了解甚少。一般说来,在非炎症条件下,激活的B细胞一旦与抗原互作,即可穿过正常BBB,并能一直滞留在CNS中,分化成浆细胞以便分泌囊内抗体。一些作者认为,免疫赦免涉及到T细胞应答的调控,而不是CNS中的抗体反应。这样看来,B细胞在BBB中的迁移需要LFA-l/ICAM-1VLA-4/纤连蛋白二者之间的相互作用。此外,正常情况下,初生B细胞中不含有CXCR3,但当B细胞分化成浆细胞前体时,CXCR3表达上调。这说明B细胞迁移至CNS的过程与在T淋巴细胞中观察到的现象类似。另外,B细胞经历捕获、压扁等阶段,穿过内皮细胞,扩散至CNS

   总之,病毒特异性抗体反应、先天免疫元件和细胞介导的免疫,对于狂犬病患者的康复而言都是必需的。因此,人们了解宿主免疫反应,包括免疫球蛋白(Ig)亚类和反应的动力学及寿命等,采取措施来获得抵抗RABV的免疫显得尤为重要。此外,在自然RABV感染时,我们需要对不同阶段和不同区间的B细胞反应有个全面认知,因为这能让我们开发更好的治疗方案来与疾病作斗争。针对RABV的宿主免疫反应的主要原理详见图2和图3所示。

RABV采取的免疫逃脱机制

   RABV常常通过肌肉或其他外围组织注射的方式进入到宿主体内。在肌肉表面,RABV G蛋白可与nAChR结合。这意味着接种位点的RABV暴露于先天和适应性免疫反应中。那么,RABV是如何进入PNS(外周神经系统)和随后的CNS中,且不被免疫系统察觉?

   许多病毒采用不同的逃避机制来逃脱宿主的免疫系统,如直接抑制宿主基因表达、隔离或伪装PAMPs,以及修饰细胞因子信号转导途径(图4)。

   多项研究表明,RABV蛋白在隔离宿主免疫应答上发挥作用,这使得肌肉组织中病毒的复制过程更加有效。宿主的某些初始先天免疫应答可被病毒封闭,这个过程取决于RABV的磷蛋白(P),当然,N蛋白和G蛋白也参与其中。

   有报道显示表达少量P蛋白的减毒RABV株与致病毒株相比,其抑制IFN-β产生的作用程度减弱,从而使RABV致病性与其逃脱免疫反应的能力直接相关。通过对RABV P蛋白展开分析,发现该蛋白在免疫逃逸中发挥作用。当编码P蛋白的基因易位至宿主基因组,RABV P蛋白的表达下调,可抑制由TBK1介导的IRF 3/7磷酸化作用。随后,该课题组发现P蛋白可与STAT1STAT2蛋白相互作用,从而抑制它们的核转运过程,还可抑制I型和IIIFNs反应中二者的反式激活。此外,P蛋白可以靶标STAT3蛋白,抑制IL6依赖性信号转导途径,这暗示着除了IFNs之外,P蛋白也具有免疫拮抗作用。而且,IFN信号的抑制可能具有某种潜在作用,它可改变保护性RABV特异性免疫应答的性质,促使其从传统的偏好Th1型转变为神经系统障碍程度更低的Th2型。

   在病毒感染时,N蛋白也能阻止RIG-1的激活和IIFN的诱导,从而抑制宿主的先天免疫反应。这种效应与P蛋白无关,且是以RIG-1水平作用于TBK1/IRF3的上游。

    RABVM蛋白能够抑制NF-kB反应,阻断由IFN-β调节的先天免疫反应激活过程,这对封闭RNA病毒的复制至关重要。然而,固有的实验室病毒株由于不具备与p65/RelA(一个NF-kB亚单元)互作的能力,并不能抑制I型干扰素的产生。

   考虑到G蛋白在免疫反应中的活性,固有RABV株表达的高水平G蛋白与凋亡的诱导、BBB渗透性增强以及CNS中先天免疫反应增加有关。另一方面,RABV街毒可以表达低水平G蛋白,从而逃脱宿主的先天免疫反应。这些研究证实RABV G的表达水平能够决定先天免疫反应的诱导及病毒的致病能力。

  RABV逃脱宿主免疫反应的另一机制是将非许可细胞作为交通工具而将自身运输到外周神经细胞,病毒可在此复制并传播至CNS。此外,RABV感染后,DCsI型、IIMHC以及IIFN的表达均呈现下调趋势。有一种假说指出,成熟DCs迁移至淋巴组织的过程可被致病性RABVs所抑制;同时,当病毒在逃避宿主有害性免疫反应时,成熟的Dcs能够促使RABV扩散至PNS中的神经细胞内。

   RABV不仅可以影响被感染细胞中的先天免疫反应,还能抑制范围更广的炎症反应。Wang等人证实与感染低致病性实验室毒株(CVS-B2C)的小鼠相比,感染致病性RABV的小鼠大脑能够诱导表达低水平趋化因子,如CCL2CXCL10CCL5,这些对白细胞招募至炎症位点而言至关重要。

   除了上述讨论的相关机制,我们也重点关注了由凋亡导致的细胞死亡过程,它可以抑制病毒的复制和传播,也可被病毒选择性地用于逃脱宿主的免疫反应。

   有观点表明凋亡的发生是免疫反应对抗RABV感染的结果之一,其作用迅速,以便摧毁已感染的神经元和限制病毒的传播。另外,研究显示RABV可能参与到凋亡过程,因为凋亡可被视为病毒用来抑制CNST细胞炎症反应的策略之一。事实上,已有报道提出致病性CVS和减毒PV株均能导致CD3 T细胞渗透到CNS中。作者观察到渗透性T细胞在接种7天后出现凋亡,这使得感染了CVS但并未感染PV株的小鼠CNST细胞数量显著下降。

   CNS中,运动神经元和T细胞分别以组成型的方式表达FasLFas。当Fas T细胞与FasL结合后,渗透性T细胞开始凋亡。在RABV感染过程中,当病毒扩散至CNS时,FasL表达会被下调。

   Fernandes等人发现当人感染了经由haematophagous蝙蝠传播的狂犬病病毒时,其CNS中会出现CD4CD8 T细胞的凋亡,这个现象表明此类淋巴细胞可以通过细胞因子及趋化因子的刺激后,被吸引到大脑区域。该发现预示着已感染病毒的神经元和淋巴细胞可以分别表达FasLFas。因此,这些细胞的凋亡过程与Lafon等人在实验中观察到的现象一致。

   RABV感染过程中的凋亡现象起初被认为是由RABV G蛋白的表达单独诱导的,因为病毒表面的G蛋白水平与凋亡的程度呈现直接正相关。研究证实,致命RABV和减毒RABVG蛋白由于在神经细胞中具有不同的分布模式,导致它们分别具备抑制或促进凋亡的能力。然而,最近绝大多数工作显示G蛋白水平并不是影响细胞凋亡的唯一因素。

   细胞凋亡被认为参与了狂犬病病毒的致病过程,这个结论是依据神经细胞株的体外研究和接种实验室毒株的小鼠实验而得出的。不过,感染野生型病毒(银发蝙蝠RABV)的小鼠尽管表现出与疾病相关的临床症状,但其体内仅含有极少量的TUNEL阳性神经元,这暗示着细胞凋亡或许并不是一个必需的神经致病性机制。因此,感染了致病毒株的细胞与感染了减毒毒株的细胞相比,前者能触发更低程度的神经元凋亡,但反过来也会被神经功能性障碍影响,导致轴突和树突膨胀及形成珠状。这些形态变化足以解释临床症状和体征的形成过程。

   对已感染RABVCNS组织细胞凋亡现象开展研究,结果显示CNS中存在不同的细胞类型,如炎症细胞、巨噬细胞、少突胶质细胞,以及大量的渗透性T细胞,这暗示着上述细胞可能是RABV自然感染诱导产生的细胞凋亡的靶标。此外,RABV可以利用凋亡来破坏NK细胞的保护作用,正如在动物实验研究中显示的那样。然而,Fernandes等人在自然感染RABV的人CNS区段中并未观察到NK细胞的凋亡。对此现象的一种解释是RABV直接干扰NK细胞的激活和抑制NK细胞受体活性,使它们丧失细胞毒性。

   为了探究不同天冬氨酸蛋白酶和细胞死亡通路在RABV感染和致病过程中的作用,Kip等人评估了两种不同RABV毒株诱导的巨噬细胞死亡过程。有趣的是,一旦感染致命毒株(CVS-11),对宿主而言,天冬氨酸蛋白酶3介导的细胞凋亡的危害性远大于其保护性作用。相反,当感染减毒RABV时,天冬氨酸蛋白酶1和(或)天冬氨酸蛋白酶11介导的细胞焦亡能够限制疾病的发展。凋亡与焦亡的博弈可能影响RABV致病力,这主要是通过影响炎症状态(释放促炎细胞因子,如IL-1β)来激活宿主的适应性免疫系统。该项研究为上述观点提供了有力证据。这也能解释减毒RABV感染是如何增强宿主防卫反应,促进病毒快速消亡。

   最可能出现的情景似乎与感染致病RABV诱导宿主表达神经元免疫抑制分子(如B7-H1HLA-G)有关。HLA-G通过提升IL-4IL-3IL-10的分泌以及下调IFN-γTNF-α的产生来影响细胞因子的平衡,使其偏向Th2模式。B7-H1能抑制病毒性脑炎中炎症因子的表达,如iNOSTNF-α。因此,RABV感染可通过上调B7-H1FasL分子表达来主动抑制T细胞反应和CNS中炎症反应,但也可从CNS本身固有活性中受益,触发免疫抑制来维持全身的内稳态。

   最近,Liu等人证实RABV已演变出某种机制来破坏宿主免疫反应,主要是通过诱导不完全自噬来实现。在不完全自噬过程中,自噬体不能通过CASP2介导的AMPKMAPK1途径与溶酶体进行有效地融合。这个研究暗示着当自噬功能受到干扰时,可能会危害主要组织相容性复合体分子的病毒抗原呈递,并削弱宿主对抗RABV的适应性免疫。

   由此看来,RABV利用多种机制来逃避宿主免疫,旨在成功逃脱和进行病毒复制。而且,阻碍神经元发生凋亡似乎是病毒的一种破坏性策略,可被其用来逃脱清除,同时还能提高病毒的持久性,这样可确保RABV能在宿主体内长久存活。

亮点

先天免疫反应

l   病毒通过叮咬或抓挠进入皮肤或肌肉后,即可立即触发宿主先天免疫反应;

l   RABV被外周和CNS中的Toll样受体及视黄酸诱导基因1类受体识别;

l   野生型RABVs刺激轻微或不产生炎症反应,这与减毒RABVs刚好相反;

l  神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞可以产生细胞因子和趋化因子来抵抗RABV侵染,如IFN-γIL- 6TNF-αCCL2CXCL10,它们能够干扰BBB的渗透性;

l  细胞因子刺激的小胶质细胞会对神经元造成损伤。

细胞免疫反应

l  CD4 T细胞与CD8 T细胞相比,前者在RABV感染时的保护作用更强;

l  RABV感染过程中,IFN-γ能够诱导积极反馈和产生高水平的CXCL10,促使CXCR3+ CD4 T细胞迁移至CNS中;

l  CXCL10Th细胞分化成Th17Th1细胞的过程中发挥作用,Th17Th1细胞分别能够产生IL-17IFN-γ

l  CD4 T细胞在应对嗜神经感染的BBB渗透性增强方面是必需的,然而该过程并不需要CD8 T细胞和B细胞的参与;

l  Th1细胞对于诱导IgG2a抗体产生和延迟病毒清除是必需的。

体液免疫反应

l  渗透性B细胞产生的RABV特异性抗体对于病毒的清除至关重要;

l  VNA的保护性作用已在应对RABV威胁的疫苗接种及动物实验模型中得到证实;

l  感染野生型RABV的动物不会产生VNAs,而减毒RABV株可诱导高水平的VNAs

l  感染减毒RABV可诱导DC的分化及成熟,进一步刺激B细胞成熟和产生VNA

RABV使用的免疫逃脱机制

l  RABV P蛋白通过抑制IRF3STAT途径来干扰IFN-β信号转导通路;

l  与致命性街毒相比,表达低含量P蛋白的减毒RABV株对IFN-β产生的抑制作用更弱;

l  RABV N蛋白阻碍RIG-I的激活和IIFN的产生;

l  RABV M蛋白可以抑制由NF-κB调节的IFN-β反应;

l  RABV感染时,FasL表达上调;

l  凋亡可能是一种逃脱机制;

l  天冬氨酸蛋白酶3介导的凋亡对于狂犬病人而言,其危害性远大于保护作用;

l  天冬氨酸蛋白酶1和(或)11介导的细胞焦亡在限制RABV感染方面发挥作用;

l  RABV P蛋白与BECN1结合后,可诱导不完全自噬并推动RABV基因组的复制。

结束语

   显然,实验室条件下的减毒RABV,而非野生型RABV,能从CNS中清除,这主要是因为减毒RABV能够激活淋巴器官中适当的先天和适应性免疫反应,诱导效应细胞进入循环系统。由CNS驻留细胞起始的其他机制对增强BBB渗透性也是必需的,可使循回的免疫细胞渗透入CNS组织来行使其效应功能。现有知识表明RABV利用一个潜在的多要素策略,可多层面破坏宿主的免疫。这些逐渐积累的证据主要来源于遗传修饰的病毒或宿主的实验结果。因此,当宿主无法建立保护性免疫应答时,会导致自身的死亡。

   最近几年,有关狂犬病免疫方面的知识日益增长,但要想更好理解先天和适应性免疫在感染固有或野生型RABV宿主外周及CNS两种环境下的互作,还有待开展进一步研究。在这种情况下,解答一些悬而未决的问题可以给我们提供一个广泛的视野,以便开展更全面研究。例如,RABV感染能够诱导B细胞死亡吗?值得注意的是,凋亡是一种“沉默”形式的死亡,它能抑制炎症反应。由激活诱导的B细胞死亡能够视为病毒的一种有利机制来削弱VNA的产生或避免由诱发性凋亡导致的显著炎症形成吗?经证实,B细胞可在体外条件下被RABV感染,但是这种感染是否取决于病毒毒株?病毒是只感染外周血,还是也能感染组织?感染了RABVB细胞能产生细胞因子吗?一旦B细胞获得了产生细胞因子的能力,它们能够通过极化作用或抑制作用来交叉调控免疫反应,甚至可以负调控整个免疫系统。因此,对天然RABV侵染的不同阶段和不同区间中的B细胞反应加深了解,有助于人们研发更好的策略来对抗RABV的感染。

   尽管免疫应答的建立对抵抗CNS中的 RABV至关重要,炎症和潜在的免疫调节机制之间的平衡也很关键。有趣的是,调节性T细胞(Treg细胞)可以选择性靶标CNS特异性Th细胞,同时能使抗病毒免疫保持全面工作状态[169]。这暗示着Treg细胞的损耗可诱导一个恶化的以淋巴细胞渗透性增强和凋亡神经元数目增加为特征的炎症反应。因此,Treg细胞在RABV感染时CNS特异性T细胞反应的起始中到底起到何种作用?目前免疫调节机制还有待进一步研究,以便我们理解在应对CNS损坏而组织损伤最小化时促炎症因子和抗炎症因子所发挥的不同作用。

   狂犬病的暴露前预防是有效的;然而,针对病症患者的治疗方案还有待提高。现有认知让我们相信RABV诱导宿主产生的先天免疫调控可在CNS组织中传播,使得免疫效应因子进入CNS,来维持或消除感染的RABV。不过,考虑到治疗制剂(为了提高BBB渗透性)可能通过增强不受控制的BBB这种方式对CNS功能产生负面影响,我们应采取措施来保护机体的内稳态以及避免诱发新的神经元损伤。

   我们同时关注了近期发表的旨在开发狂犬病治疗新策略来替代现有方案的相关研究。例如,Tsekoa等人证实,与人RIG(狂犬病免疫球蛋白)在暴露后的动物模型攻毒试验中所起的作用相比,携带有人型、无海藻糖且N端为多聚糖的单克隆抗体具有更强的保护作用,进而可抵抗RABV的感染。这项研究表明提高对抗体种群中不同糖基化模式的理解,有助于人们研发新的治疗方案。因此,抗体的糖基化在其中和活性中到底发挥什么作用?如果能够提供丰富的特异性IgG糖基化形式,是否可以降低中和活性疗法所需的RIG含量?

   目前,许多不同的双特异性单克隆抗体(bsAb)形式可被人们合理利用,以便开发治疗性蛋白。然而,目前还没有任何研究以书面形式报道过bsAb可被用于治疗狂犬病。因此,我们可开发一个用于狂犬病治疗的bsAb,其臂的一端靶标内源BBB受体,另一端靶标RABV G蛋白。这个bsAb可以穿过BBB,同时维持自身在CNS内的中和活性,这也暗含着一个新的狂犬病治疗策略。出于同一目的,Phoolcharoen等人采用不同技术合成了一种新抗体分子,它可以识别神经接头和BBB处的nAchR,且具有潜在的RABV中和活性。这暗示着植物来源的ScFv-RGV融合蛋白可以提高抗体片段在BBB中的穿透能力,而且不会影响抗体的中和活性。

   尽管抗体的中和活性已被证实与Fab和抗原之间的互作有关系,但抗体的作用机理还有待进一步了解。已有报道阐述了Fc区域在对抗各种传染性病原物的mAb中和活性中所起的作用。这些数据为开发传统单克隆抗体之外Fc优化的mAbs中和抗体提供了理论支持。

   上述提及的绝大多数研究主要聚焦于中和抗体活性。然而,先天机制也可被用于疾病治疗。简单说来,Mehta等人证实,动物模型中重组的人INF-α可以诱导细胞因子分泌(TNF-αIL-6)的负调控,为狂犬病的治疗提供一个新方案。此外,考虑到RABV感染免疫细胞的死亡涉及到凋亡过程,我们推测用天冬氨酸蛋白酶3抑制剂阻断细胞发生凋亡,可能会给疾病带来有利的一面,能提高新狂犬病治疗方案的可行性,该方案的标靶是宿主而不是病毒。

   本综述主要聚焦于对抗RABV的先天和适应性免疫反应的诱导以及在侵染早期病毒如何破坏宿主的免疫系统。同时,我们简要讨论了如何将这些知识应用到狂犬病免疫学研究的新方向。

   值得强调的是,提升发病机理的相关知识,包括RABV和宿主免疫系统、神经和免疫接口之间复杂的相互作用,有助于我们今后开展鉴定新靶标和研发有效的狂犬病治疗新方案的相关工作。

附录(图注)

1 动物咬伤或外围接种RABV后的连续性步骤示意图。(A) 病毒在肌肉中复制(B) 病毒通过逆行轴突通路在PNS中的轴突内运输。(C) 病毒在脊髓运动神经元中复制和快速上行至大脑,(D)    脑部感染(E) 沿着神经离心式扩散至唾液腺。

2 针对减毒RABV株的免疫反应。A)在外周,肌肉中的RABV颗粒被宿主识别后,即可触发先天免疫反应。B)在进入到CNS后,病毒诱导宿主产生抗病毒分子、趋化因子和炎症分子,可促进免疫细胞(TBNK细胞 )从外周的渗透。C)细胞因子,如IL-17,可诱导BBB的瓦解。D)NKCD8 T细胞清除被感染的神经元。E)CD4 T细胞和B细胞在抗体产生方面的胞内协作。

3 针对RABV街毒株的免疫反应示意图。A)RABV诱导小神经胶质细胞产生炎症细胞因子和一氧化氮。B)免疫细胞从外周移动至CNS中。C) 部分免疫细胞经历由Fas-FasL机制调控的凋亡。D) B细胞产生IL-4和抗体。E) 细胞因子环境偏向于Th2型。



4 RABV免疫逃脱机制示意图。A)RABV的机制蛋白能够阻碍NF-kB的诱导,影响IFN-β的产生。B)RABV导致树突细胞中IMHCIFN的下调表达。C)一旦感染,神经元表达B7-H1HLA-GFasL,它们可以与其相应的在T细胞表面表达的受体互作(对应的受体分别是:Fas 对应FasL, PD-1 对应B7-H1CD8对应HLA-G)D)分子间的互作触发CD4/CD8 T细胞和NK细胞的损耗和(或)死亡。E)这有助于病毒在神经系统中的逃脱。RABV P蛋白抑制STAT3信号,作用方式与STAT1STAT2类似,影响细胞因子的生成。抑制符号(┴)暗示了RABV P蛋白、M蛋白或N蛋白采用的阻断机制。

来源:Immunological aspectsof rabies: a literature review. Katz ISS, Guedes F, Fernandes ER, Dos RamosSilva S. Arch Virol. 2017 Jul 19. doi: 10.1007/s00705-017-3484-0.




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