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韩春雨老师的文章做了啥? 精选

已有 15922 次阅读 2016-5-9 22:59 |系统分类:论文交流

最近,朋友圈被韩春雨老师刷屏了,各种致敬,欢呼和反思……可是这篇文章主要研究了什么内容呢?不知道?韩老师该伤心了。本人也很关心该领域进展,看过几十篇CRISPR/Cas9的文章,使用该技术自己动手拿到了敲除小鼠,现在就简单介绍一下韩老师这篇文章。


原文链接在这里,欢迎有兴趣的同学自己阅读,(Nat Biotechnol现在影响因子40左右)文章不长,一共7页,包括4个主要结果, 5个Figure.

Nat Biotechnol. 2016 May 2. doi: 10.1038

DNA-guided genome editing using the Natrono bacterium gregoryi Argonaute.

Gao F, Shen XZ, Jiang F, Wu Y, Han C.


1N. gregoryi来源的Ago蛋白能够在DNA的指导下断裂DNA



已有报道5'磷酸化的单链DNA能够指导TtAgo和PfAgo断裂DNA,但是所需温度高于65度。作者用PSI-BLAST办法在NCBI上搜索到TtAgo和PfAgo的同源蛋白AFZ73749.1(NgAgo),纯化后能够在37度把环状DNA线性化。体系需要NgAgo,13–25 nt的正向和反向5'磷酸化的单链DNA。(图一)


2NgAgo可结合单链向导DNA,并使双链目标DNA断裂



转染293T细胞系后并未发现与NgAgo结合的DNA,说明人类细胞中5'磷酸化的单链DNA低到难以检测的水平。转染NgAgo表达载体和不同的向导DNA后发现NgAgo只能结合5'-磷酸化的单链DNA,但不能结合5'-磷酸化单链RNA,而且NgAgo与单链DNA的组装只发生在NgAgo产生后很短的时间内,一旦组装完成,其中的DNA在37 °C就不能被替换了。这种只能使用“原版”向导DNA的特性保证了NgAgo忠实地切割设计好的靶点(图二)

那么下一个问题,NgAgo在什么位置断裂DNA呢?实验结果显示NgAgo可以在ssDNA指导/目标区域1−20 nt内随机删除几个核苷酸,但作用方式和外切酶不一样。细胞转染实验证明NgAgo与Cas9-sgRNA体系效率相同,ssDNA长度为24 nt时效率最高(图三)


3NgAgo作用的目标范围广泛而错配耐受性低



NgAgo还有什么样的特点呢?作者又做了三种实验:在NgAgo蛋白上添加入核信号NLS后转染细胞,使用5个不同的ssDNA断裂目标基因DYRK1A,结果显示都可以断裂;使用42个不同的ssDNA断裂其它8个目标基因,结果一致;在多种细胞中重复了实验,也都可以断裂目标基因。(图四)

为了研究核苷酸错配对NgAgo活性的影响,作者突变了gDNA的每个碱基,单个碱基错配会导致活性下降73–100%,第8到11位突变活性下降85~100%,而任意位置的连续三个碱基突变会导致失活。这一点上NgAgo-gDNA体系要优于Cas9-sgRNA体系。


4NgAgo可以指导DNA片段精确地插入基因组中



在用同源DNA供体共转染293T细胞系后,DNA片段通过HDR修复精确地插入基因组中,同源重组后的细胞会表达GFP,流式细胞检测结果显示阳性细胞比例高达11.7%,且没有像Cas9一样造成脱靶(图5)。


好了,以上就是原文主要内容,文章还有大量附加材料。匆忙翻译,错误之处还望大家指正!欢迎转载,请保留二维码哦。


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