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【PROTAC】新药开发系列（九）里程碑之动物体内试验通用性

已有 4042 次阅读 2019-3-2 12:31 |个人分类:PROTAC|系统分类:论文交流| protac, 蛋白降解, 泛素化, 体内试验, 动物试验

近日，清华大学饶燏课题组在Nature子刊Cell Discovery上发表了一篇有意思的文章《A chemical approach for global protein knockdown from mice to non-human primates》。他们将一种用雷帕霉素连接泊马度胺制成的PROTAC成功敲除小鼠、大鼠、猪和恒河猴体内的FKBP12蛋白。读者请自取亮点，个人认为这是小分子蛋白降解新药的又一个里程碑，因为它证明了其在动物试验中的通用性和有效性。

1摘要

虽然CRISPR/Cas9技术被使用得越来越多，用于蛋白质敲低的常规遗传修饰方法也非常成功。但我们还是缺乏用于在成年动物中实现蛋白质敲低的有效技术，特别是对于诸如非人类灵长类的大型动物。这里，我们报道了一种基于PROTACs技术的化学方法，该方法在体内有效且快速地敲除FKBP12蛋白。腹膜内和口服给药均导致小鼠的FKBP12快速、稳健和可逆的降解。在大型和小型动物（小鼠、大鼠、巴马猪和恒河猴）中均成功地证明了该方法的效率和实用性。此外，这种方法还可用于有效地敲除其它目标蛋白，如布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）。

2背景介绍

蛋白质敲低的动物模型是用于研究靶基因功能性丢失的后果的有力策略。传统上，研究基因功能性丢失的后果主要通过遗传修饰，如RNA干扰，转录活化剂样效应核酸酶，基于重组的基因敲除，CRISPR-Cas9系统和其它基因组编辑策略。然而，将这些策略应用于大型动物仍具有很大的挑战性，特别是在非人灵长类动物中。这些动物在基础研究和新药发现中一直扮演着重要角色。但，上述这些方法在一定程度上无法控制基因功能的急性和可逆性变化。而且，潜在的遗传补偿在基因敲除模型中会产生自发突变的并发症，这可能会误导结果。此外，许多基因的缺失还导致动物的胚胎致死，这都阻碍了相关的科学研究。

蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）使用一个Linker，一端连接目标蛋白的抑制剂，另一端连接E3泛素连接酶的结合配体分子。PROTAC代表了一种化学敲低策略，PROTAC分子将目标蛋白与E3连接酶拉拢，使得E3可以泛素化标记目标降解蛋白，然后通过蛋白酶体降解目标蛋白（图1a）。Crews研究组第一个报道基于多肽的PROTAC的开发，随后，越来越多研究者致力于通过PROTAC技术成功降解其感兴趣的蛋白质。目前，PROTAC主要用于发现新的抗癌剂，因为它们具有优于经典抑制剂的独特优势。据我们所知，这种新策略尚未用于大型动物模型中去实现全局蛋白质敲低。与人类密切相关的模式物种恒河猴是一种独特的模型，常用于研究其类人基因组导致的各种疾病，环境因素的可控性以及实时监测代谢表型。然而，尚不清楚PROTAC是否在非人灵长类动物中起作用。

图1 RC32诱导细胞中FKBP12的降解

在这里，我们证明了PROTAC技术是一种方便、快速和可逆的化学方法，可以在活体动物（特别是猪和恒河猴）中全局和快速（24-72小时）降解蛋白质。停用PROTAC后，蛋白质水平恢复，表明该方法在自我调节的动物体内具有成本效益和时间效率。此外，我们使用PROTACs在小鼠和恒河猴中敲低了FKBP12，研究了FKBP12在维持心脏功能中的重要作用。

3结果

3.1 降解FKBP12的PROTAC设计

在本研究中，我们选择FKBP12作为目标蛋白，理由如下：首先，FKBP12蛋白在哺乳动物中广泛表达。通过结合Ca²⁺-release channel (RyR受体)，FKBP12调节Ca²⁺信号传导来行驶重要功能，特别是在心脏。其次，因为FKBP12是高度保守的蛋白质，这种化学敲低策略有望用于产生具有靶向蛋白质敲低的大型动物模型（例如，猪和非人类灵长类动物）。第三，通过普遍的方法对FKBP12的全局敲除会因为严重的发育性心脏缺陷（例如，高血压，心室不紧密和室间隔缺损）导致胚胎致死。FKBP12在成人心脏功能和疾病发展中的作用仍然难以捉摸。已经证明雷帕霉素是FKBP12的一种有效的特异性配体，它以高亲和力（kd=0.2nm）调节mTOR 信号传导。因此，我们通过聚乙二醇连接雷帕霉素（一种FKBP12特异性配体）和泊马度胺（一种与含CRBN的E3蛋白连接酶结合的特异性配体）设计了降解FKBP12的PROTAC分子（图1b）。该异双功能分子通过含CRBN的E3连接酶将FKBP12泛素化标记，并通过蛋白酶体途径降解FKBP12。因此，我们合成了一系列的PROTACs，并测定了它们降解Jurkat细胞中FKBP12的潜力。

我们将具有雷帕霉素和泊马度胺的嵌合体分子名为RC32（图1c）其显示出最有效的FKBP12降解能力，用其处理细胞12小时后，导致50％蛋白质降解，DC50=0.3 nM。

为了确定RC32诱导的泛素化降解是否是通过泛素-蛋白酶体途径导致FKBP12降解（图1e）。我们在添加RC32之前，用蛋白酶体抑制剂硼替佐米或卡非佐米处理细胞。实际上，蛋白酶体的抑制完全阻断了RC32诱导的FKBP12降解，表明这种降解是通过泛素-蛋白酶体途径。加入FKBP12抑制剂雷帕霉素或CRBN抑制剂泊马度胺，均有效地阻断了RC32对FKBP12的降解，进一步证实了这种降解需要RC32与FKBP12和CRBN的结合。值得注意的是，在降解FKBP12.6时，RC32在Jurkat细胞中没有诱导FKBP51和FKBP11的明显降解（图1h）。使用一定剂量的RC32可以控制FKBP25的降解。但RC32对S6K和S6的磷酸化没有影响，这可能对划分FKBP12的mTOR独立功能有益处。当RC32被洗掉后，FKBP12蛋白水平在96小时内完全恢复（图1g）。为了进一步评估RC32的效率，使用来自不同物种和原代细胞的不同细胞系进行检测（图1i）。FKBP12在来自人，大鼠，小鼠和鸡的细胞中以高度一致的模式被RC32有效降解。重要的是，RC32在原代心肌细胞中表现出高降解效率，这表明其在体内降解FKBP12的潜力。

3.2 通过RC32快速有效降解小鼠和大鼠中的FKBP12

在确认细胞系和原代细胞中的高降解效力后，我们又在小鼠、大鼠、猪和非人灵长类动物模型中利用RC32诱导蛋白质敲低。这些模型是研究人类疾病的宝贵工具。虽然小鼠和大鼠已广泛用于科学研究，但在猪和非人灵长类动物中构建蛋白质敲低模型要困难得多。猪的异种移植在生物医学研究中特别有吸引力。虽然非人灵长类动物与研究人类疾病和制定治疗策略更相关，但猴子的遗传修饰非常昂贵，且耗时，同时技术上具有挑战性。些在大型动物模型中的限制严重阻碍了它们在生物医学研究中的应用。因此，我们尝试应用PROTAC这种化学方法构建代表性的蛋白质敲低动物模型并研究靶蛋白的功能。

图2 腹腔注射RC32在小鼠体内全面敲低FKBP12

我们首先研究了RC32对小鼠的影响。令人惊讶的是，用RC32治疗仅1天（腹腔注射，30mg/kg，每天两次）后，在治疗小鼠大部分器官中检测不到FKBP12蛋白，大脑除（图2a，b）。有趣的是，FKBP12的显著降解也发生在眼睛中。相反，RC32对脑组织中FKBP12的降解没有影响，这可能是由于RC32无法通过血脑屏障。很有意思的是，在治疗1天后（30mg/kg，每天两次），RC32能够降解FKBP12约1周。此外，在停用RC32后，不同器官/组织中的FKBP12得到恢复（图2c，d）。有趣的是，FKBP12在心脏中的恢复率是RC32停用后13天内最慢的。停用PROTAC后，FKBP12的mRNA水平表现出急性和代偿性增加，然后迅速恢复并保持在接近正常的水平。为了降解脑中的FKBP12蛋白，我们使用脑室内（i.c.v.）给药。正如所料，来自i.c.v.处理脑的组织中的FKBP12被降解（图3a，b），而其它器官/组织中的水平没有受到影响。FKBP12在神经系统中普遍表达，并且已知调节淀粉样蛋白前体蛋白的定位和加工。我们的研究结果表明，脑内局部蛋白质敲低可能为治疗阿尔茨海默病开辟了一条新途径。当口服递送RC32时，FKBP12在小鼠体中显着降解（图3c，d），这突出了口服PROTAC的临床潜力，这比先前报道的依赖性注射更方便。此外，每12小时仅两次腹腔注射（20mg/kg；图3e，f），在Sprague-Dawley大鼠中发现高降解效率。

图3 口服给药后RC32对FKBP12的敲低和小鼠i.c.v.和大鼠腹腔注射结果

3.3 用PROTAC生成的FKBP12敲低小鼠的应用

FKBP12是心脏发育所必需的，但其在心脏稳态中的生理重要性仍不清楚。因此，我们在小鼠中使用这种新方法进一步探索了它在成人心脏中的功能。当FKBP12耗尽时，兰尼碱受体保持在开放状态，导致Ca²⁺流失。我们检查了响应RC32给药的Ca²⁺火花的特性，发现它们的持续时间在RC32处理组中大大延长，如用载体或RC32处理的小鼠心肌细胞的共聚焦显微镜线扫描图像所示（图4a，b）。与对照相比，Ca²⁺的性质在RC32处理的小鼠心肌细胞中火花显著改变。火花的半峰全宽从1.80±0.22增加到1.97±0.26μm（图4c）。在PROTAC治疗组中发现较长的半衰期持续时间（图4d）。上升时间从14.3±4.67延长到17.2±5.85ms，半衰期从34.5±12.7衰减到44.5±13.5ms（图4d）。这些结果表明RC32诱导小鼠细胞Ca²⁺流失。持续的Ca 2+流失是导致心脏功能障碍，并且是心脏肥大的主要原因。接下来，我们使用超声心动图检查对照组和RC32治疗小鼠的心脏形态和功能。如图 4e，f所示，RC32治疗组与对照心脏相比，射血分数减少（EF;14.1％），缩短分数缩短（FS;18.0％），表明心室收缩活动减弱。第11天，用RC32处理的心脏壁试验显示，小鼠的EF减少14.9％，FS减少18.0％。此外，左心室（LV）质量（图4g，19.9％），LV后壁厚度，舒张压（LVPW;d）（图4h，12.5％）和心室舒张期间室间隔宽度（IVS;d）随着RC32处理显着增加。RC32处理的小鼠在第30天出现心肌肥大。然而，LV质量，LVPW;d和IVS;d在载体组中没有变化。由于心肌肥大的发展，RC32治疗组在第30天的EF和FS高于第11天。超声心动图表征的数据表明FKBP12在成人心脏中起关键作用，其降解导致心脏病。总之，这些结果表明使用PROTAC敲除FKBP12的小鼠是研究FKBP12功能有价值的模型，特别是在心脏中。

图4 RC32给药对小鼠心肌细胞和心脏功能的影响

3.4 巴马猪FKBP12的有效降解

鉴于上述小鼠和大鼠的成功，我们在随后的实验中建立了蛋白质敲低猪模型。当巴马猪（20千克）给予RC32（8毫克/千克，每天两次）2天时，FKBP12蛋白在大多数检查的器官中被有效降解（图5a，b）。RC32给药后，在心脏、肝脏和肾脏中仅检测到残留水平。与我们在小鼠中的发现一致，腹膜注射RC32对猪脑中的FKBP12降解没有影响。尽管如此，我们在大型动物中使用PROTAC化学策略，并在如此短的时间内建立蛋白质敲低模型方面取得了显著进步。因此，我们认为受RC32成功启发的化学方法可能会产生有价值的特定蛋白质敲低猪用于人类疾病和异种移植的研究。

图5 RC32对巴马猪FKBP12的敲低

3.5 验证FKBP12在恒河猴中的降解和功能

受猪模型结果的鼓舞，我们将研究扩展到恒河猴（图6）。给药3天后（8mg/kg，腹腔注射，每天两次），通过RC32有效降解猴子的心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺和胃中的FKBP12。在脂肪组织、膀胱和肠中可检测到很少或没有FKBP12（图6a）。RC32未能降解大脑中的FKBP12，与小鼠和猪的结果一致。此外，我们在RC32给药后3天和15天，以及在停用RC32后7和21天进行功能性心脏研究。类似于FKBP12敲低对小鼠的作用，RC32处理降低EF（第15天为6.7％，图6b）和FS（在第15天13.4％，图6C）以及收缩压线（图6D）。另外，心率随着治疗而降低。停用RC32后，心脏功能逐渐恢复，22天后恢复到接近正常状态，伴随着FKBP12蛋白水平的恢复（图6e）。这些结果表明化学蛋白质敲低方法可用于进行自我对照研究。由于心血管疾病（CVD）是全世界死亡的主要原因，使用这种化学方法来敲除CVD相关蛋白为研究CVD的致病因素和潜在疗法提供了一种新策略。更重要的是，我们降解FKBP12的PROTAC研究为该策略提供了原理验证，用于在猴子模型中创建高效和可逆的蛋白质敲低。

图6 RC32对恒河猴FKBP12的敲低及其功能效应

3.6 扩大化学敲低策略在BTK中的适用性

最后，为了拓宽这种化学敲低方法的适用性，基于我们先前的研究（图7a），使用进一步优化的BTK降解剂产生Bruton酪氨酸激酶（BTK）-敲除小鼠。用P13IS（腹腔注射，33mg/kg，每天三次）处理11天后，脂肪、胸腺、腹部淋巴结和腋窝淋巴结中的BTK有效降解（图7b，c）。此外，在骨髓、肺和肠淋巴结中观察到BTK的显着降解（图7b，c）。与降解FKBP12的PROTAC类似，在停用P13IS后7天恢复BTK水平（图7d）。

图7 P13IS对小鼠BTK的敲低

4讨论

总之，这些体内蛋白质降解结果表明PROTAC方法可用于在蛋白质水平上建立动物敲低模型。这种方法只需几天的给药即可实现蛋白质敲低。该技术大大减少了建立临床前研究动物模型的时间和成本，特别是对于较大的非人类哺乳动物模型。

我们已经开发出一种用PROTAC全局敲低目标蛋白的化学方法。它是一种新颖、快速和有效的方法，用于产生蛋白质耗竭的动物模型，如小鼠、大鼠、猪和恒河猴。此外，该策略还可以通过i.c.v.给药实现大脑中的目标蛋白质敲低。当口服给予PROTAC时，这种方法也非常有效。停用PROTAC后，FKBP12蛋白水平在一定时间内恢复。该模型适用于自我控制的生物医学研究，通过化学策略将FKBP12敲低的小鼠和恒河猴表现出Ca²⁺流失和Ca²⁺增加心肌细胞产生火花，从而导致心脏功能障碍。因此，可以开发这些模型用于心脏药物筛选。另外，该方法也可以应用于其它目标，例如BTK。对于那些没有充分记录的特异性结合物的靶蛋白，开发PROTAC可能是一个挑战。然而，由于配体只需与靶蛋白具有较低亲和力就足以应用PROTAC进行蛋白降解，PROTACs策略将提供更多实现有效蛋白质敲低的方法。总而言之，PROTAC有望作为现有工具的补充方法，以快速、可控和可逆的方式用于体外和体内研究。