前面三篇文章介绍了CraigM. Crews等人在2001、2003和2004年的开创性工作。他们合理地利用与泛素连接酶E3体系SCF（Skp1-Cullin-Fbox）、VonHippel-Lindau tumor suppressorprotein（VHL）与甲硫氨酰氨肽酶2（MetAP2）、雌雄激素受体（ER和AR）和抗免蛋白FKBP12（FK506bindingprotein）的激动和抑制剂，设计合成了用于降解MetAP2、ER、AR和FKBP12的PROTAC分子。蛋白试验验证了PROTACs可快速降解目标蛋白。

图1PROTAC泛素化降解机制

但以前的PROTAC均使用了多肽，虽然已经可以透过细胞膜，但多肽PROTAC本身分子量高、且肽键不稳定，导致合成、纯化和稳定性方面的诸多问题。为了克服这一系列问题，研究者采用了“整体小分子”的PROTAC设计。

“整体小分子”PROTAC设计是一端采用了选择性雄激素受体调节剂（SARM）如图2中的分子，Ki=4nM，一种非甾体AR配体；另一端利用了另一个E3体系MurineDouble Minute 2（MDM2）抑制剂Nutlin，如图3中的分子，IC50=90nM。

图2 AR与SARM的结合模式

图2中的红色圈，显示了SARM与PEGLinker连接的位置。图3中的红色圈，则显示了Nutlin与PEGLinker连接的位置，环酰胺的N处。

图3 MDM2与Nutlin的结合模式

MDM2是一个已知的抗癌靶蛋白，其抑制剂作用机制是是竞争性结合在其与p53结合的位置（如图4，Nutlin和p53与MDM2结合在同一位点），从而阻止p53被泛素化标记，使得p53不被蛋白酶体降解。

图4 MDM2（绿色）与Nutlin（白色）和p53（紫色）的结合模式

到目前为止，MDM2的抑制剂还未有获批上市的。推进最快的两个化合物是RG7112和RO5045337也只是完成了一期临床，如图5。国内江苏亚盛医药的MDM2抑制剂在2017年7月获CFDA一期临床批件。

图5 MDM2抑制剂研究进展

研究者采用图6的路线合成了“整体小分子”PROTAC。接下来使用10μM的PROTAC与Hela细胞在37℃下共孵育。7小时后制备细胞裂解物，通过SDS-PAGE分离，并转移到硝酸纤维素膜上，使用AR抗体评估Western印迹以确定AR蛋白水平。

图6“整体小分子”PROTAC的合成路线

试验结果显示，与空白试验对比，用PROTAC处理的细胞中AR明显降低（图7）。为了验证PROTAC诱导雄激素受体降解是通过蛋白酶体途径，研究者用10μM蛋白酶体抑制剂环氧酶素预处理细胞1小时，然后进行空白试验和PROTAC降解试验。结果如图7所示，PROTAC介导的降解具有蛋白酶体依赖性，环氧酶素与PROTAC竞争性结合AR，导致AR降解减少。

图7 “整体小分子”Protac降解AR的效果

下一周，将和大家分享一篇PROTAC设计的综述：Designand Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads AreBetter Than One，敬请关注分迪科技微信公众号。

1. Schneekloth,A. R.; Pucheault, M.;Tae, H. S.; Crews, C. M., Targeted intracellularprotein degradation induced by a small molecule: En route to chemicalproteomics. Bioorg Med Chem Lett 2008, 18(22), 5904-8.

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