图1 Ovalicin与MetAP2共价键结合

甲硫氨酰氨肽酶（MetAP）在细胞内的基本功能是切除细胞内新合成蛋白质的N端甲硫氨酸，为蛋白质后续功能的发挥奠定基础。真核细胞中该蛋白有两种亚型：MetAP1、MetAP2。研究表明，抑制MetAP2可以调控内皮细胞的生长周期，抑制新生血管生成，如其共价键抑制剂烟曲霉素（Fumagillin）和卵假散囊菌素（Ovalicin）。此外，抑制MetAP2，还能够减少人体脂肪的产生，并增加消耗，还能够减轻饥饿感，减少因脂肪过多而造成的炎症反应。Zafgen公司针对此靶点，开发了第一代减肥药Beloranib，但因在100多人的临床试验中造成2名病人因血栓死亡，2016年未获FDA批准。该公司继续研发了第二代MetAP2抑制剂ZGN-1061，2017年5月Zafgen公司公布该抑制剂的1期临床结果显示：ZGN-1061可快速吸收和清除，耐受性好且安全，克服了第一代抑制剂导致血栓形成的副作用，且参与试验的患者平均每周体重可以下降约1磅（约合0.45公斤）。

图2 PROTAC通过SCF复合物Box泛素化降解目标蛋白的过程

17年前（2001年）RaymondJ. Deshaies（美国院士）和CraigM. Crews（Arvinas公司创始人）等人首次提出了蛋白降解靶向嵌合分子（PROteolysis TArgeting Chimericmolecules，PROTACs）这一概念。他们第一次成功设计与合成了PROTACs双功能分子用于降解甲硫氨酰氨肽酶2（MetAP2）。研究者选择了含有Hrt1（SCF）的Skp1-Cullin-Fbox作为催化泛素与蛋白连接的复合物，选择甲硫氨酸氨肽酶-2（MetAP-2）作为降解蛋白（因其表面含有35个赖氨酸残基，更容易被泛素化标记）。设计的PROTACs用来募集MetAP2靶向SCF复合物以进行泛素化标记和降解。PROTACs结合MetAP2的部分是与其共价结合的血管生成抑制剂Ovalicin，PROTACs结合SCF复合物的部分是一个被F-box蛋白β-TRCP特异性识别IKBα上的磷酸肽。最终的试验结果证明Protac-1可以募集MetAP2到SCFβ-TRCP进行泛素化标记并降解。

图3 第一批PROTACs的合成路线

研究者使用Ovalicin和IKBα上的磷酸肽（IPP）来验证Protac-1是与其竞争性的结合MetAP2。如下图，+表示添加了IPP或OVA，-表示没有添加。结果可以看出，Protac-1在10um的浓度下可以形成MetAP2-Protac-1复合物。

图4 Protac-1与Ovalicin和IPP竞争性结合MetAP2

研究者还使用LLnL和Epoxomicin（二者为蛋白酶体抑制剂）来证明Protac-1是通过泛素化降解途径降解MetAP2的。令人惊讶的是，15分钟MetAP2-Protac-1复合物开始明显降解，30分钟基本清除完全。这一点也证明了泛素化降解过程是一个快速的生物催化反应，快速清除目标蛋白是蛋白降解机制的特色。

图5 Protac-1通过蛋白酶体途径降解MetAP2

下一周，我将继续与大家分享利用Skp1-Cullin-Fbox泛素降解雌激素（ER）和雄激素受体（AR）的PROTAC设计。

分迪科技  PROTAC践行者！

1. Sakamoto,K. M.; Kim, K. B.; Kumagai, A.; Mercurio, F.; Crews, C. M., Protacs: chimeric molecules that target proteins to theSkp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. ProcNatl Acad Sci U S A 2001, 98 (15), 8554-9.

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