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癌症生物学的那些事II:一次偷懒带来的发现 精选

已有 7816 次阅读 2015-4-4 06:12 |系统分类:科研笔记

中国的先哲老子说:“天欲其亡, 必令其狂。” 这句话在西方古希腊人那里的版本是:“上帝欲使人灭亡,必先使其疯狂。”

癌症正是以这种方式致人于死地的:让细胞疯狂的增殖,不论空间和时间,直至最后死亡。

Src基因被发现后,根据当时流行的“一个基因一个酶(蛋白)”的观点,很多科学家开始着手寻找和鉴定Src基因编码的蛋白产物。蛋白是基因功能的执行者,只有手里有了这个蛋白,才有可能研究Src是怎样让一个正常细胞失去理智而疯狂增殖的。

科学家起初试图用体外翻译体系来得到Src基因的蛋白产物。然而,当时DNA重组和基因克隆技术还处于萌芽状态,Src基因并没有被克隆出来,更不用说它的碱基顺序了,大家只是根据Peter Duesberg的实验知道Src基因位于RSV基因组的3’端。因此,通过这个方法来发现和鉴定Src的蛋白产物非常困难,幸运点的如Tony Hunter也只是拿到了Src蛋白的部分片段,功能研究更无从谈起。

Ray Erikson决定用免疫沉淀的方法将Src蛋白钓出来。如果把细胞比作一个大湖,细胞里面的各种蛋白就是湖里种类繁多的鱼。要钓到你想要的鱼,你得准备特殊的鱼饵。这个鱼饵在免疫沉淀里就是抗体,抗体越特异越灵敏,成功的机会就越大。Erikson和他的博士后Joan Brugge 花了近三年时间才得到这样的抗体,并随之成功地获得了Src蛋白。他们将这一蛋白命名为pp60v-src,意思是一个来源于病毒Src基因的被磷酸化了的分子量为60KDa的蛋白(phosphorylated protein)。

Src蛋白被磷酸化意味着两种可能:和Src蛋白一起被沉淀下来的复合物里还含有一种蛋白激酶,或者Src蛋白本身就是一种蛋白激酶,它可以将自己磷酸化。Erikson更倾向于后者。一年后,他们证实了Src蛋白具有蛋白激酶活性,并且认为发生磷酸化的氨基酸是苏氨酸。

Src蛋白是一个蛋白激酶的消息使得Tony Hunter有些坐立不安,他需要尽快确定他正在研究的和Src蛋白有类似功能的中T抗原蛋白(多瘤病毒组分)是否也是一个蛋白激酶,并且需要弄清是丝氨酸还是苏氨酸被磷酸化,这是当时两个已证实的可以发生磷酸化修饰的氨基酸。

1979年6月12日,Tony Hunter在Salk研究所做了第一次实验以确定中T抗原蛋白是否是一个蛋白激酶。他首先用32p标记中T抗原蛋白,再将之和中T抗原蛋白免疫沉淀复合物进行磷酸化反应,然后将磷酸化蛋白在酸性环境下水解成单个氨基酸,最后在pH1.9的酸性缓冲液中(保护已磷酸化的氨基酸)用纸相层析方法将这些单个氨基酸分开,和磷酸化苏氨酸或丝氨酸参照物进行对比,就可以知道是哪个氨基酸发生了磷酸化。

Tony Hunter在这天下午有些疲倦,他偷懒没有配制新的酸性缓冲液,而是用了一瓶反复使用过的酸性缓冲液进行纸相层析。第二天,在放射自显影的片子上,他发现磷酸化的氨基酸位于磷酸化苏氨酸和丝氨酸之间,说明既不是苏氨酸也不是丝氨酸发生了磷酸化。

Tony Hunter大学时主修化学,他的化学知识告诉他除了苏氨酸和丝氨酸,还有一个氨基酸也包含可以被磷酸化的羟基基团,这个氨基酸就是酪氨酸。

利用他掌握的化学知识,Tony Hunter用一简单的方法制备了一些磷酸化酪氨酸,用于作为纸相层析电泳的参照物来确定他所发现的磷酸化氨基酸是否真的是酪氨酸。实验结果是肯定的。有趣的是,当他用新鲜配制的酸性缓冲液进行纸相层析时,他发现磷酸化酪氨酸和磷酸化苏氨酸完全重合,不能被分开。原来,那瓶反复使用过的酸性缓冲液的pH值已经不再是1.9,而是1.7,就是这微小的差别导致了两个磷酸化氨基酸在电泳场迁移的不同。Tony Hunter故意让新鲜配制的酸性缓冲液放置几天,用这些 “老化”的酸性缓冲液,他再次肯定是酪氨酸被磷酸化。Tony Hunter后来将纸相层析电泳条件改进为在pH1.9和pH3.5的双向电泳,可以成功地将三种磷酸化氨基酸分离开来。

Tony Hunter用他建立的新方法重新检测了Src蛋白的激酶活性,发现Src蛋白实际上也是一个酪氨酸蛋白激酶,这一结论不久被Ray Erikson证实。不久,David Baltimore报道另一个逆转录病毒蛋白v-Abl也具有酪氨酸蛋白激酶活性。1980年,Stanley Cohen纠正了他们两年前关于表皮生长因子(EGF)受体是苏氨酸蛋白激酶的观点,证明表皮生长因子受体具有酪氨酸蛋白激酶活性。鉴于表皮生长因子受体活化和人类多种肿瘤密切相关,这一发现将酪氨酸蛋白激酶不仅和细胞生长,而且第一次和人类肿瘤发生发展联系起来。

在确定了Src蛋白是一个酪氨酸激酶后,寻找它的激酶底物就成了研究Src致癌机制的关键。Ray Erikson等发现纯化的V-Src或者C-Src在试管内可以导致很多蛋白质发生酪氨酸磷酸化,但是只有找到Src的真正生理底物才能解释Src致癌之谜。随着新技术例如蛋白质二维电泳尤其是酪氨酸磷酸化抗体的应用,一大批Src蛋白激酶的底物被鉴定。在这些底物中,Ras和PI3K现在被公认为最为重要的两个底物,它们和它们所在的信号转导通路控制着细胞增殖,细胞周期调控和细胞迁移等多种和肿瘤发生密切相关的细胞过程。

由于他的一次 “偷懒”带来的发现以及酪氨酸蛋白激酶在细胞生长信号转导通路中的重要作用,Tony Hunter被称为“激酶之王”。2001年,FDA批准了第一个酪氨酸蛋白激酶抑制剂GLEEVEC用于治疗慢性髓性白血病,标志着运用“魔法子弹”治疗白血病成为现实,而这距离Paul Ehrlich第一次提出“肿瘤治疗魔法子弹”的设想已过去了一百多年。




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