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【每周文献】R蛋白Pit和OSSPK1互作激活OsRac1和植物免疫 PNAS-2018

已有 774 次阅读 2019-9-9 19:47 |个人分类:每周文献|系统分类:科研笔记

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背景介绍

虽然关于R蛋白介导植物免疫的研究已经很多,但是鉴定到的R蛋白下游直接信号分子很少,因此我们对于R蛋白介导植物免疫的分子机制知之甚少。

在前期研究中发现,GTPase OsRac1参与了植物免疫过程,并且鉴定到了一个R蛋白PitOsRac1互作。Pit参与了水稻对稻瘟病的免疫过程。OsRac1位于Pit的下游,影响ROS的产生和细胞死亡。并且OsRac1的膜定位是激活OsRac1必须的。

科学问题

OsRac1没有GEF domain,它是如何激活OsRac1的呢?

主要结论

1.OsSPK1Pit互作

已有研究表明GEFs促进GDPGTPase上解离,是GTPase的激活因子。在前期研究中发现两种GEFsOsRacGEF1OsSWAP70)参与OsRac1介导的植物免疫。

问题OsRacGEF1OsSWAP70是否与Pit互作,参与了Pit介导的激活OsRac1的过程?

酵母双杂显示,Pit并不与OsRacGEF1OsSWAP70互作,但是和另外一个GEFs OsSPK1互作。Pit N端的CC domainOsSPK1C端互作,并使用Co-IP(瞬时转化烟草),Pull-down以及BiFC实验进一步验证。

2.OsSPK1参与了Pit介导的植物免疫

问题OsSPK1Pit互作,它是否参与了Pit介导的植物免疫过程?

使用RNAi方法降低OsSPK1的表达,Pit介导的植物免疫降低。

3.OsSPK1作为OsRac1GEF发挥作用

问题OsSPK1含有典型的GEF domain,它是否可以激活GTPase OsRac1

先通过酵母双杂检测OsSPK1是否可以和OsRac1直接互作,发现OsSPK1C端可以和OsRac1互作,并通过Co-IPPull-down进行了验证。

体外生化试验表明:OsSPK1 C端可促进OsRac1释放ADP。并且OsSPK1 RNAi株系中,Pit诱导的OsRac1活化程度降低,说明Pit诱导的OsRac1活化依赖于OsSPK1 

4.PitCC domain是和OsSPK1互作,介导OsRac1激活以及植物免疫必需的


技术方法

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Take Home Message

R蛋白的表达量通常会比较低,有时在原生质体中的表达量也不高,可以像本文中的那样,在烟草叶片中瞬时表达,这样可以收集到较多的样品,再进行蛋白富集,以得到更多的蛋白。

 




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