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【每周文献】R蛋白Pb1和WRKY45互作影响稻瘟病抗性 2013-PNAS

已有 410 次阅读 2019-8-20 23:41 |个人分类:科研随笔|系统分类:科研笔记

PNAS

背景介绍

1. Pb1是一个稻瘟病抗性基因,可以使水稻对稻瘟病表现较强的抗性。

2. Pb1编码一个CC-NBS-LRR蛋白,但是Pb1并没有P-loop,并且其他的几个R蛋白保守的motif也发生退化,暗示Pb1可能有不同的机制。

3. 有研究表明,一些R蛋白的核定位或者细胞质到细胞核的转运对其功能的行使非常重要。

4. SA在植物系统获得性免疫过程中发挥重要作用。在水稻SA信号通路中,WRKY45发挥重要作用。

科学问题

本文对Pb1增强稻瘟病抗性的分子机制进行了解析,发现了Pb1和SA信号通路之间的crosstalk。

主要结论

1. Pb1的CC domain可以和WRKY45发生互作

1)之前有研究报道,R蛋白的CC domain可以和WRKY转录因子互作。受此启发,本文对Pb1和是否也能和WRKY蛋白家族成员互作进行了检测。

2)作者挑选了不同家族的WRKY转录因子,通过酵母双杂系统发现,只有WRKY45会和Pb1-CC发生互作,并通过GST-pull down,Co-IP以及 split LUC系统进行了验证。

3)通过预测及定点突变,发现了四个疏水氨基酸影响Pb1-CC和WRKY45的互作。

新问题:Pb1-CC和WRKY45互作,对Pb1介导的稻瘟病抗性有什么影响呢?

2. Pb1介导的稻瘟病抗性依赖于WRKY45

1)WRKY45转录和蛋白水平都和稻瘟病抗性正相关

2)在Pb1+或者Pb1OX背景下knock down WRKY45,会使稻瘟病抗性降低

3)过表达影响和WRKY45互作的位点突变的Pb1(Pb1-Quad),稻瘟病抗性增强效果减弱

3. Pb1的核定位是增加稻瘟病抗性必须的

1)GFP-Pb1在细胞核和细胞质中都有定位,WRKY45-GFP定位在细胞核中。并通过核质分离实验对Pb1的亚细胞定位进行了验证。

2)Pb1的核定位对其功能是不是必须的?

构建了HA-Pb1-NES载体,转化植株发现,稻瘟病抗性减弱

3)既然Pb1的核定位那么重要,稻瘟菌侵染会改变其亚细胞定位吗?

并不会!

原文没有回答的问题:Pb1的胞质定位是不是也是其增强稻瘟病抗性所必须的?

4.Pb1介导的稻瘟病抗性部分依赖于SA通路

WRKY45是SA通路中的重要组分,Pb1介导的稻瘟病抗性和SA有什么关系吗?

在Pb1OX背景下过表达SA降解蛋白NahG,会降低稻瘟病抗性,说明Pb1介导的稻瘟病抗性部分依赖于SA通路。

5.Pb1抑制ubiquitin蛋白酶体对WRKY45的降解

1)在使用小麦胚芽提取物系统表达WRKY45蛋白时,添加MG132增加WRKY45蛋白表达量,说明WRKY45会被ubiquitin蛋白酶体降解

2)WRKY45和Pb1共表达也会增加WRKY45蛋白含量,暗示Pb1可能会抑制UBQ对WRKY45的降解,增加其稳定性。由于小麦胚芽提取物是外源表达系统,在水稻中是不是也是这样呢?

3)将WRKY45和Pb1在水稻原生质体中共表达,也会增加WRKY45的含量,并且随着Pb1蛋白的增加,WRKY45也增加。

问题:Pb1稳定WRKY45是直接的还是间接的?和他俩互作有无关系?

4)Pb1-Quad和Pb1-NES对WRKY45的稳定效果减弱,说明Pb1通过和WRKY45互作直接稳定WRKY45蛋白。

技术方法

1)水稻核质分离

水稻核质分离

2)小麦胚芽提取物体外翻译系统

小麦胚芽提取物体外翻译系统

3)体外Co-IP

体外Co-IP

Take Home Message

1)对于一些生物体内容易降解或表达量低的蛋白,可以分别进行体外翻译,得到纯化蛋白后,再进行体外的孵育和Co-IP实验。

2)WRKY45一直有双带,和Pb1共表达时,下面的条带变弱,文章并没有对这一现象进行解释。

3)R蛋白易降解,表达量低,不容易检测到。把标签放在R蛋白的N端和C端对R蛋白的检测及功能有没有影响?



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