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【每周文献】2019.08.05-2019.08.11

已有 656 次阅读 2019-8-13 14:04 |个人分类:每周文献|系统分类:科研笔记

1.R蛋白的开关平衡 2016-Plant Cell

R蛋白的开关平衡 2016-Plant Cell

本文以亚麻不同R蛋白allele为切入点,鉴定到了TIR domain和NB-ARC domain中调控R蛋白活性的位点。并进一步发现激活的R蛋白更易结合ATP,而活性降低的R蛋白则更倾向于结合ADP。另外,和ATP结合的蛋白和effector结合得也更紧密。本文进一步验证了R蛋白可作为分子开关,通过和ATP/ADP的结合,调节植物免疫的模型。

Take Home Message

  1. 提取酵母蛋白方法: postalkaline extraction method

Kushnirov, V.V. (2000). Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast 16: 857–860.

  1. R蛋白的体外表达比较困难,本文使用酵母表达。并且使用从酵母中纯化的R蛋白直接检测蛋白结合的酵母内源的ATP/ADP,这应该属于半体内实验。

  2. 检测ATP/ADP含量,ATPase活性的相关试剂盒

腺苷 5′-三磷酸(ATP)生物发光测定试剂盒 :Sigma, 货号:FLAA-1KT

二磷酸腺苷(ADP)检测试剂盒(比色法/荧光法):sigma,货号:MAK033-1KT

ADP/ATP 比率检测试剂盒:sigma,货号:MAK135-1KT

ATP酶/GTP酶活性检测试剂盒:sigma,货号:MAK113-1KT

2. NALP3结合ATP诱导炎症反应  2007-PNAS

NALP3结合ATP诱导炎症反应  2007-PNAS

Cryopyrin参与动物多聚炎症复合体的形成,属于nucleotide-binding蛋白家族。本文通过亲和色谱法,纯化到了Cryopyrin蛋白全长,证明Cryopyrin可以结合ATP并具有ATPase的活性。当P-loop上的保守位点突变后导致不能结合ATP,影响自我互作,以及和下游互作蛋白的互作,最终不能诱发炎症反应。

本文说明了Cryopyrin这类蛋白的核酸结合活性对其功能的行使是非常重要的。另外,自我互作以及和其他蛋白的互作也是行使正常功能所必需的。

Take Home Message

  1. 证明ATP结合活性的实验:ATPγS结合,竞争实验,ATP-agarose结合

ATPγS:腺苷5′-(β,γ-硫代)三磷酸盐 锂盐 水合物,sigma,A2647-5MG

ATP-agarose:sigma,A4793-1ML

ADP-agrose:sigma,,A3515-5ML

 2.和植物中的R蛋白类似,这类蛋白自我互作形成寡聚体或多聚体可能非常重要,而且核酸结合活性可能对这一过程影响非常大。

3.effector诱导R蛋白寡聚化  2006-PC

effector诱导R蛋白寡聚化  2006-PC

本研究发现,elicitor会诱导R蛋白的寡聚化(自我互作),而且这种寡聚化依赖于elicitor。P-loop突变后,elicitor无法诱导R蛋白的寡聚化,说明P-loop在elicitor诱导的寡聚化中非常重要。P-loop会影响R蛋白和ATP/ADP的结合,这也从侧面说明了结合ADP/ATP会影响R蛋白的寡聚化。

Take Home Message

将R蛋白连接不同的tag,使用Co-IP检测R蛋白是否可以寡聚化。



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