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乙烯信号简史 | “大反派”CTR1 精选

已有 8004 次阅读 2018-8-9 22:57 |个人分类:乙烯信号转导简史|系统分类:科研笔记| 乙烯, 信号转导, CTR1

在《乙烯的信号转导》一文中,我做过一个形象的比喻:我们可以把细胞比作一个等级森严的组织,每一等级职责明确。当有问题出现时,指令便一级一级传递,直到细胞做出决定,再一级一级传递出去,使细胞做出特定的反应。配体受体结合所引发的一系列胞内分子状态的改变,被称为细胞信号转导通路。通过前面的四讲,我们终于把乙烯受体家族和乙烯分子之间的那点事儿搞清楚了。其实,受体和激素分子的结合只是乙烯信号转导通路的第一道关卡。乙烯和受体的顺利会师,仅仅是迈出了万里长征的第一步。

和大多数激素受体在信号转导通路中主要起正调控作用不同,在乙烯导演的这出戏中,乙烯受体家族实实在在地扮演了一回大白脸,是名副其实的黑帮家族。它们的存在,抑制了乙烯的信号转导。在一般的影视剧套路中,大坏蛋周围总要少不了一些同流合污、鞍前马后的一丘之貉,而我们的乙烯的信号转导这出戏自然也逃不出这些套路。今天,就让我们来一起认识一下这位臭名昭著和乙烯受体家族狼狈为奸大反派”CTR1

如果仔细追究起来的话,CTR1出道并不比乙烯受体家族晚多少。1988年,乙烯受体家族的老大哥”ETR1以一篇Science文章一鸣惊人,挣来了家族的第一桶金。5年后(1993),又以另外一篇Science文章威震江湖,奠定了乙烯受体家族迅速崛起的基础。随后,乙烯受体五兄弟齐心协力,把乙烯受体家族推向了巅峰,名气原来越大,以至于今天的名扬天下。几乎与此同时,在Joseph R. Ecker的实验室里,毫不起眼的小不点儿”ctr1正在积蓄力量,静静等待着一鸣惊人的机会。

在利用三重反应筛选乙烯反应突变体的过程中,主要有两种类型的突变体最容易引人注意:一类是乙烯不敏感突变体,用乙烯处理后不出现三重反应,比如乙烯受体突变体以及各ein突变体(ein2ein3ein5等);另一类是组成型乙烯反应突变体,在空气中即可表现出明显的三重反应表型,比如在《乙烯反应突变体的筛选》一文中提到过的乙烯合成增加突变体eto1,以及我们今天的主角ctr1

值得注意的是,在前期的研究中,许多人都只注意了第一类突变体,而当时第二类突变体还没有引起人们的广泛关注。于是,Ecker实验室综合使用了EMS、双氧环丁烷以及X射线诱变的方法,对拟南芥进行大规模的诱变和筛选,寻找组成型乙烯反应突变体。1993年,相关研究成果以 CTR1, a negative regulator of the ethylene response pathway in Arabidopsis, encodes a member of the raf family of protein kinases为题发表在Cell上。文章中,研究人员对100+拟南芥进行了筛选,共筛选出400株组成型乙烯反应突变体,其中只有18株存活并成功繁殖后代。

对于组成型乙烯反应突变体,主要只有两种原因可导致此表型的出现。一类是乙烯合成途径的基因突变,致使乙烯合成量增加;另一类是乙烯信号转导通路中的基因突变,导致乙烯信号转导通路被激活。对于乙烯合成增加突变体,可用乙烯合成抑制剂AVGAminoethoxyvinylglycine)和AIBα-aminoisobutyric acid),以及乙烯结合抑制剂反式环辛烯(Trans-cyclooctene )和银处理,组成型乙烯反应的表型会被抑制。而对于乙烯信号突变体,上述四种抑制剂处理则不会影响突变体的表型。

ctr1表现组成型乙烯反应1

研究人员分别用这四种抑制剂处理上述筛选出的组成型乙烯反应突变体,根据表型可分为两类:第一类,突变体的组成型乙烯反应表型被抑制;第二类,突变体乙烯反应不受影响。第一类突变体的表型可能是由于乙烯合成量增加导致,而第二类则可能是乙烯信号转导通路中的组分发生突变导致。检测各突变体的乙烯合成量后发现,第一类突变体中乙烯的合成增加,进一步鉴定发现它们的ETO基因(ethylene overproducer, )都发生了突变,而第二类突变体的乙烯合成量和野生型相似。

ctr1突变体各时期的生长状况统计后发现,突变体各个生长时期都表现出严重的组成型乙烯反应表型,比如生长在空气中的ctr1黄化苗即可表现出三重反应;转移到光下,弯钩和子叶的展开速度也要明显比野生型慢;子叶的颜色为深绿色;莲座叶远远小于野生型;抽苔晚,花序小,早期花不育;根系不发达等等。而当野生型拟南芥持续生长在含有乙烯的环境中,也会表现出类似的表型。另外,乙烯诱导的Marker基因在ctr1突变体中也组成型高表达。

通过图位克隆,将CTR1基因定位在5号染色体上。通过染色体步移并结合筛选T-DNA插入突变体的方法,克隆到了CTR1基因。CTR1基因组长约为6.5kb,包含14个内含子,最大的ORF2466nt,编码的蛋白大小约为90kD。蛋白结构分析表明,CTR1蛋白C端具有保守的蛋白激酶结构域,并和Raf家族的丝/苏蛋白激酶具有较高的序列相似性。Raf家族的丝/苏蛋白激酶一般通过MAPK途径介导细胞的信号转导,因此CTR1也可能具有类似的机制。由于筛选出的ctr1突变体为单基因控制的隐性突变,且突变类型是功能缺失型,而突变体又表现出组成型的乙烯反应,因此CTR1应该在乙烯信号通路中发挥负调控的作用。

ctr1的图位克隆及基因结构【1

在前期研究中鉴定出一些乙烯不敏感突变体。其中,ein1是单基因控制的显性突变,在幼苗和成株期都对乙烯不敏感;ein3是单基因控制的隐性突变,具有稍弱的乙烯不敏感表型。将ctr1和上述乙烯不敏感突变体杂交,进行遗传分析。结果显示:ctr1ein1双突表现出组成型乙烯反应表型,而ctr1ein3双突则表现出乙烯不敏感表型。说明CTR1作用在EIN1上或EIN1的下游,同时作用在EIN3上或EIN3的上游。另外,ctr1和乙烯受体突变体的遗传分析表明,CTR1可能作用在ERSETR1的下游。

ctr1的遗传分析【1

我们前面介绍过,ETR1ERS被认为具有组氨酸激酶活性。而CTR1作用在ETR1ERS的下游,并可能有MAPKKK活性。那么,这两种不同的激酶在乙烯信号转导通路中又有着怎样剪不断理还乱的关系呢?

1998年,Caren Chang实验室在PNAS上发表题为Association of the Arabidopsis CTR1 Raf-like kinase with the ETR1 and ERS ethylene receptors的文章。文章中使用酵母双杂交系统发现,CTR1N端可以和ETR1以及ERS蛋白C端的组氨酸激酶结构域互作,同时还特异地和ETR1receiver domain互作。

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CTR1ERS以及ETR1互作【2

随后,Joseph J. Kieber实验室对CTR1蛋白及其功能进行了更加细致深入的研究,相关成果于2003年以Biochemical and functional analysis of CTR1, a protein kinase that negatively regulates ethylene signaling in Arabidopsis为题发表在The Plant Journal上。文章中,研究人员使用昆虫蛋白体外表达系统,纯化了CTR1重组蛋白,并发现它们在体外具有和Raf-1相似的丝/苏激酶的活性。将CTR1N端删除,其体外激酶活性并不受影响。对ctr1功能缺失突变体突变位点分析后发现,多个突变位点都破坏了CTR1的激酶结构域。而体外激酶活性检测发现,突变体激酶活性确实被破坏,说明完整的激酶活性是CTR1行使功能所必须的。

CTR1C端具有保守的激酶结构域,但N端的功能还不清楚。研究中,科研人员筛选到了一个突变位点位于N端的功能缺失突变体ctr1-8ctr1-8发生一个碱基的突变,导致G354E的替换,该突变不影响蛋白的激酶活性,但破坏了和ETR1的互作。将ctr1-8转化到ctr1突变体中,不能恢复突变体的表型。说明和ETR1的互作是CTR1行使功能所必须的,并且两者互作后会关闭乙烯信号通路。

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ctr1-8不能恢复突变体的表型【3

既然乙烯受体和CTR1发生互作,那么两者在拟南芥细胞中应该是共定位的。几乎与 Kieber组的文章同时(2003),G. Eric Schaller课题组在The Journal of Biological Chemistry发表文章 Localization of the Raf-like kinase CTR1 to the endoplasmic reticulum of Arabidopsis through participation in ethylene receptor signaling complexes。科研人员通过共纯化(co-purification)的方法发现,和乙烯受体一样,CTR1也定位在内质网上。基于以上发现,他们推测CTR1可能作为乙烯受体复合体的一部分,两者相互合作,共同抑制乙烯的信号通路。

那么CTR1参与调控乙烯信号转导的机制是什么呢?它又是如何影响下游组分的呢?欲知后事如何,请听下回分解:伟光正“EIN2

【参考文献】

1Kieber, J. J., Rothenberg, M., Roman, G., Feldmann, K. A., & Ecker, J. R. (1993). CTR1, a negative regulator of the ethylene response pathway in Arabidopsis, encodes a member of the raf family of protein kinases. Cell72(3), 427-441.

2Clark, K. L., Larsen, P. B., Wang, X., & Chang, C. (1998). Association of the Arabidopsis CTR1 Raf-like kinase with the ETR1 and ERS ethylene receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences95(9), 5401-5406.

3Huang, Y., Li, H., Hutchison, C. E., Laskey, J., & Kieber, J. J. (2003). Biochemical and functional analysis of CTR1, a protein kinase that negatively regulates ethylene signaling in Arabidopsis. The Plant Journal33(2), 221-233.

4Gao, Z., Chen, Y. F., Randlett, M. D., Zhao, X. C., Findell, J. L., Kieber, J. J., & Schaller, G. E. (2003). Localization of the Raf-like kinase CTR1 to the endoplasmic reticulum of Arabidopsis through participation in ethylene receptor signaling complexes. Journal of Biological Chemistry278(36), 34725-34732.


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3 范振英 黄永义 王庆浩

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