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入门的DNA提取实验对自己的启发 精选

已有 5149 次阅读 2010-12-31 11:40 |个人分类:未分类|系统分类:科研笔记| DNA, 大胆尝试

转眼到了2010年的最后一天了,可能每个做研究的人都有总结的习惯。虽然毕业了,但是原实验室肯定在开总结报告会。我一直想把最近从一个简单实验技术中亲身体会到的可能大家早已熟知的想法与感受写出来,算是对自己的一个总结与提醒吧。
在读书学习期间,很简单的分子生物学实验就是提取基因组DNA,方法是老师已经确立好的,整个过程经过几次就很熟悉了,觉得这可能是最入门、最简单的技术了。自认为已经基本掌握了这项技术的原理,即Tris buffer提供细胞裂解pH值环境,SDS是阴离子表面活性剂能裂解细胞膜,SDS可破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离,EDTA则抑制细胞中DNase的活性;而蛋白酶K可将蛋白质(如组蛋白)降解成小肽或氨基酸,使完整的DNA分子分离出来。
在自己参加工作后,要涉及到另外一个昆虫物种的研究,思路与技术均是互通,心里没有太多担心,便开始了新的实验室工作,自己又当老板又当学生。在进行生化实验的同时,带着两个学生开始了分子生物学实验,由于实验室前期积累较少,所以试剂、仪器要自己订购、调试。第一次提取过程之前,专门阅读了原始的参考文献(方法专门针对本物种),由于手头没有disposable pestle,所以用glass homogenizer进行匀浆,一步步按照文献来,匀浆后55消化20min,然后后续进行14000g离心,结果发现现象和之前的现象不一样,有很多白色油脂类物质,一定是变化物种导致的,应该是脂肪体细胞导致,但还是继续往下做,到最后用nanodrop检测dsDNA260nm处特征吸收峰和浓度,结果吸收峰很典型,比值也很合理,但是抽提的DNA总量不太高。
过了一段时间,订购的disposable pestle到位,就不用麻烦的glass homogenizer,采用之前实验室的全套仪器、耗材和操作过程,这下问题来了。20个样品中只有5个样品具有正常的吸收峰与比值,而其他样品蛋白含量显然太高,导致提取失败。排除了试剂的因素外,接下来就分析原因:
1、物种改变:之前的昆虫个体较小且体壁较柔然,而现在的物种的消化生理特征完全不同,脂肪体含量非常高,而且体壁与内部组织只有用玻璃匀浆器才可以有效破碎,现在使用塑料disposable pestleEP管配合达不到之前的效果;由于要进行群体研究,样本量大,而要用玻璃匀浆器很不方便,只能用disposable pestle。但这一步带来的不便怎么克服?
2、之前查阅文献看到过有60或者65℃进行消化的,而蛋白酶k的最佳活性温度是55-58℃,不知能否采用更高温度;
3、用小鼠尾巴提取DNA可以过夜消化,能否采用过夜方法?
初步分析的结果就是几个疑问,需要逐个去尝试才能确定最佳条件。
此时,我想起老师之前说过的一些话,在进行试验条件摸索时,在明白原理后,胆子要大一些,某些参数最初设置范围要大,例如PCR的退火温度,不要以1℃的间隔去设置退火梯度。
因此,初步选择了58℃、4h的消化条件。结果有一定改善,但是提取的成功率还是不高。这时我才真正意识到自己的条件可能还是不合适。继续摸索,设置60℃、4h的条件,结果相对较好,成功率达到70%,第三次延长时间至过夜12h,成功率达到80%。到此时,我也就逐渐明白了,要敢于尝试并不断总结,第三次将参数设置为65℃、过夜12h,成功率达到90%以上。
至此,整个方法的条件也就确定下来了,整个过程中我也体会到了很多,对跟着实习的学生也是最好的教育过程,比我跟他讲空洞的试验技术要领与思路效果好得多。仔细回味这个简单的过程,首先是个人原因,这点先不说,以下几点是我的一些体会:
1 有时候,老师说的话学生自认为听明白并掌握,当老师重复的时候觉得在浪费时间,我一开始就是未能真正的放开思维的束缚去大胆尝试;听老师的话,并不是简单的几个字啊,需要用心去理解,举一反三。
2 对于文献中的方法要充分理解其原理与每一步骤的理由,不能完全依赖,毕竟各自采用的仪器设备以及其他条件不尽相同,要联系自己的实际情况,敢于创新(说得有点大)。
学生毕业后,走上工作岗位,面临的问题多了,需要处理各种关系,如与领导、同事相处,自己还要独立的设计实验路线,如果面临一个为接触过的领域,难度就更大了;此外,还要自己去争取各种经费,写本子的能力也要不断加强。跑题了,对刚起步的青年研究者来说,很多事情都要亲自去做,大到各方面文献阅读,开辟新研究领域,购置各类设备,确定短期研究路线,小到具体的试验技术的建立与攻克。
好了,一个简单的试验对我自身来讲,学到很多,今后肯定还会有很多问题,可能对很多优秀的研究人员来说有点简单幼稚。不管怎样,祝所有的科研人员(尊敬的老师与坚强的学生)在新的一年能够工作顺利,早日收获科研的果实。





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