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细胞总动员(Cell Go!) 第五章 MTT试验

已有 6350 次阅读 2012-5-11 11:59 |个人分类:科研经验|系统分类:科研笔记|关键词:细胞总动员 常圆圆

第五章   MTT试验

   经过几天的努力,小杨和本科做毕业论文的学生,终于富集了大量的经过离子交换层析柱纯化的多糖,得到了三个组分,可以测试这些组分哪些具有较强的抗肿瘤活性,这也是自己课题中最关键的一步了。
    得到冻干的样品,小杨立刻称量好样品,在细胞室用无血清的培养液溶解样品,配制成不同浓度的溶液,方便加样。
   常圆圆在旁边坐着现场指导。
  “首先,你需要铺96孔板,每个孔的细胞浓度都必须基本一致,这样,会减少人为误差;其次,在铺板的时候,要做对照组合空白组以及阳性对照组,便于以后计算抑制率。”
  “那如何保持细胞浓度一致呢?”
  “你先离心,得到细胞沉淀,加入一定的培养液,然后用血球计数板数细胞,计算细胞浓度,根据得到的细胞浓度再按照一定的比例进行稀释,得到你所需要的浓度,一般,96孔板的细胞浓度要保证在2.5万左右,即每个孔大概含有5000个左右,每个孔长满大约在10万个细胞左右。”常圆圆解释道,“另外,你还需要在96孔板四周一圈加上PBS缓冲液,防止边缘效应。”
   小杨按照常圆圆的吩咐,做好前期准备,分别加入培养液和一定浓度的细胞悬液。
  “这样你可以按照自己药品的种类和设置不同的浓度来决定你接下来如何进行96孔板的排布。”常圆圆补充道。
   24小时培养之后,该往每个孔加入样品了,小杨小心翼翼的算好每孔加入20微升的样品各需要多少初始浓度的样品,然后,按照自己的浓度梯度加入了药品,放入培养箱中培养48小时,检测48小时多糖对癌细胞的抑制率。
  “培养完后,你要记得每个孔加入20微升的MTT试剂,MTT为四唑盐,其化学名称为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑嗅盐,商品名为噻唑蓝,其可以和活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶反应,使MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶物甲瓚并沉积在细胞中,死掉的细胞没有这个功能。”常圆圆嘱咐道,“加完MTT试剂反应4个小时后,加入二甲基亚砜,其可以溶解细胞中的甲瓚,然后震荡10分钟,使其充分溶解,在酶联免疫检测仪测其吸光度值。”
   小杨在常圆圆的指导下,顺利完成了MTT比色试验,获得了较好的结果。
 


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