参考资料：http://en.wikipedia.org/wiki/Biohydrogen

目前人们对氢气的需求量十分巨大。尽管没有精确统计资料，但根据估计，氢气需求量2011年已经达到9000亿立方。炼油厂是氢气生产和消费大户，大约4%的氢气采用点解水产生，96%的氢气是用化石燃料生产，其中48%用天然气，30%用碳氢化合物，18%是用煤。随着油砂加工、天然气液化和煤炭气化等项目的增加，预期近年内氢气的需求量将不断持续增加。许多国家的环境污染压力也促使炼油厂加强天然气和石油的脱硫，进一步增加了氢气的需求。

随着石油资源逐渐耗竭，比较可行的是用氢气取代化石燃料。用氢气作为替代能源的关键技术包括氢气的储存、运输和末端用户。随着氢气的储存、运输和末端用户等关键技术价格不断下降，氢气作为能源有希望在2020年进入市场。

发酵制氢或全细胞催化制氢技术，能量消耗低。全细胞催化能有效降低水的裂解活化能，不依赖于额外能量，只利用有机质产生氢气。

一、绿藻制氢技术

1939年，美国芝加哥大学德国科学家Hans Gaffron发现，在某些情况下绿藻（Chlamydomonas reinhardtii）可从产氧变成产氢。此后，Gaffron和许多科学家一直无法解释这一现象。上个世纪90年代后期，加州大学Berkeley分校Anastasios Melis教授发现，如果把培养基内的硫去掉，绿藻就从产氧（正常光合作用）转变成产氢。Melis教授进一步确定了产生氢气的酶是氢化酶（hydrogenase），当氧气存在时，这种酶产氢功能丧失（失活）。如果没有硫，则氧气无法在蛋白内流动，绿藻氢化酶免受氧气破坏而保持产氢活性。莱茵衣藻Chlamydomonas moewusii也是一种理想产氢绿藻。美国能源部阿贡国家实验室目前正尝试找到调节氢化酶的方法，以让这种过程可和光化作用共存，这种技术将可以获得大量廉价氢气。

按照目前技术，需要大约2.5万平方公里土地种植大豆才能满足美国的能量需求。1 kg氢气等价于1加仑汽油，现在1 kg氢气价格为$13.53 / kg，美国能源部的目标价格是$2.60 / kg。实现这个目标必须将目前光氢能转率从1%提高到10%。据能源部估计，一个加油站每天加满100辆汽车需要300公斤氢气，目前技术生产300公斤氢气需11万平方池塘，里面有0.2 g/l细胞密度，深度需要10厘米。通过开发耐氧铁氢化酶或提高电子转化效率的绿藻是目前这一领域研究的重点。

二、细菌发酵制氢

细菌发酵制氢能进行工业化生产，将主要依靠有机酸光发酵过程，因为有机酸是影响细菌发酵制氢效率的关键因素。有机酸资源非常丰富，可以用污水和农作物作为资源。最重要的有机酸是醋酸、丁酸和丙酸（注意：这些有机酸恰好是人类肠道内肠道细菌产生的调节免疫的重要物质，也许和肠道细菌产氢气有一定关系），细菌发酵制氢最大的优点是不依赖葡萄糖。由于工业化需要持续产生氢气，细菌发酵制氢在这方面仍存在不足。虽然现在有许多细菌发酵制氢的研究论文，但没有工业化规模的技术。实验室技术是工业化的基础，目前细菌发酵制氢有暗发酵、光发酵和复合发酵三种类型。

1、暗发酵产氢技术

许多细菌具有产生氢气的潜力，例如G+梭状芽胞杆菌属具有天然高效产氢能力。这类细菌分裂速度快，能形成芽胞，这都是工业化生产需要的重要优点。梭状芽胞杆菌在混合培养基，常温和高温，pH从5.0到6.5之间都可以产生氢气。

暗发酵不需要光，混合培养时不同类型的细菌共同在发酵罐内生长，不同类型的细菌相互配合，可将有机废物有效转化为氢气和有机酸。

梭状芽胞杆菌通过氢化酶催化的可逆反应2H⁺ + 2e<=> H₂，这个化学反应对实现发酵氧化还原平衡很重要。随着氢气的不断产生，氢气分压不断增加，根据化学平衡原理，氢气产生速度会受到抑制（酶活性也有可能受到氢气的反馈调节）。这种因素不仅会限制氢气转化效率，甚至为维持氧化还原、能量代谢和生长的平衡，细菌会转换为其他代谢模式。

肠道细菌如大肠埃希菌和阴沟肠杆菌也是发酵产氢的候选者。和梭状芽胞杆菌用氢化酶的方式不同，肠道细菌产氢原理是把甲酸分解成氢气和二氧化碳，生物学目的是从培养基清除有毒的甲酸。甲酸分解不是氧化还原反应，对发酵的氧化还原平衡没有影响（这种思路也可以用于分析复杂生物细胞内的生物化学反应）。这种解毒反应对大肠杆菌有重要意义，能避免形成芽孢。甲酸分解也是不可逆反应，氢气分压不影响这个反应速度。大肠杆菌是分子微生物学的最常用工具，利用这种细菌产氢的代谢工程方法受到普遍关注。

氧气可以杀死专性厌氧菌梭状芽胞杆菌，但氧气不能杀死兼性厌氧菌肠道细菌，肠道细菌可在有氧条件下迅速生长，并可以在氧气耗竭时从有氧代谢迅速转化为厌氧代谢模式。由于不同代谢模式同样能量底物的能量转化效率不同，细菌在厌氧条件下生长明显缓慢（能量利用效率下降）。由于兼性厌氧菌能在有氧条件下快速生长，并在氧气被消耗后迅速转化代谢模式，开始快速制造氢气。

工业化细菌发酵产氢需要稳定的发酵状态，必须控制细菌的稳定性，原料中往往也含有细菌，可能会导致发酵系统细菌类型的变化。肠道细菌和大部分梭状芽胞杆菌属于常温细菌，理想的生活温度是30C，而多数环境微生物都是如此。因此如果要保持发酵系统内细菌不被原料细菌污染，可以对原料进行消毒，例如先用低温对原料进行处理，但消毒也存在一些问题。另外一种方法是补充更多发酵菌种，以维持发酵菌的优势。高温梭状芽胞杆菌如阿波罗栖热袍菌也可以用来发酵产氢，因为这些细菌最佳生活环境是70C，原料细菌不易在这样的温度下生长。

发酵产生的有机酸对细菌有毒性，高浓度有机酸会抑制发酵过程，而且可以导致代谢模式变化和速度变慢（如芽孢），发酵过程中会伴随二氧化碳的产生，可采用被动法分离。发酵也可以将一些底物转化为生物质能而不是氢气，生物质能是富含碳氢化合物的副产品，可以重新送会发酵系统以确保系统稳定。通过外循环管路，有机酸从生物质能中分离后，其他生物质能重新送回发酵系统。传统的发酵系统，必须小心控制稀释率，因为稀释率可影响系统内细菌浓度和有毒终产物（有机酸和溶剂）毒性。更先进的电发酵技术可将生物质能和水分离，能有效降低有机酸的毒性。

暗发酵产氢由于有机物不完全降解和有机酸产生而存在缺陷，光发酵产氢可克服这些缺点。

2、光发酵产氢气

光发酵的特征是需要光作为能源，这一技术依赖光合作用维持能量的供应，利用光作为能源代替糖正是该技术的优点，因为光能取之不尽。

所有植物、藻类和部分细菌具有光合作用能力。利用光合作用吸收光提供代谢能量，蓝藻可以在产氧光合作用条件下产生氢气。但无硫紫菌(PNS)如球形红属只能在不产氧光合作用条件下产生氢气。

球形红细菌能在将98%-99%的有机酸传化为氢气，暗发酵技术可持续产生有机酸废物，那么这种技术和暗发酵技术就具有互补性，两者联合开展就是复合发酵产氢技术。

光发酵细菌能吸收波长400-1000 nm的光（可见到红外），藻类和蓝藻只能吸收400-700 nm的可见光。目前限制光发酵技术的主要问题是造价比较高。为了大量采集和吸收光线，产业化生产需要占有巨大的表面和理想的透光材料，这导致设备成本的很高。用光纤可以将光线进行合理分配，并能克服衰减。球形红细菌光发酵需要常温条件。光纤能将控制热量并可以对有效波长的光进行筛选。

3、复合发酵技术

将暗发酵和光发酵结合起来的发酵技术就是复合发酵技术，也是最有效的发酵产氢气技术。其最显著优点是将暗发酵技术产生的有机酸废物作为光发酵技术产生氢气的底物。

工业化发酵产氢必须满足经济性、副产物最小的目标要求。复合发酵技术在这方面具有独特优点，能通过光发酵有效减少有机酸排泄。但复合发酵技术面临的最主要困难是渗出液中不仅存在有机酸，也存在含氮化合物如氨等，这些含氮化合物会抑制固氮酶活性。基因工程技术可以克服这种问题。但是，基因工程细菌也存在一定应用困难的问题。伯明翰大学开发的选择性电分离有机酸技术也能解决这个问题。电分离技术的能量消耗适合于复合发酵技术的需要。

三、代谢过程

氢气产生的基本代谢过程是利用铁氧还蛋白的还原。

4H+ + 4 ferredoxin(red) → 4 ferredoxin(ox) + 2 H2

这个过程中，铁氧还蛋白氧化后需要重新还原激活。这个过程需要NADH将电子传递给铁氧还蛋白。

2 ferredoxin(red) + NADH2 → 2 ferredoxin(red) + 2H+ +NAD+

催化这些氢形成过程的酶拥有特殊的金属原子簇，需要许多蛋白质接近活性中心。氢气形成酶活性会受到氧气的抑制，因此需要将酶和氧气分离。产氢酶有三种主要类型，铁-铁氢化酶、镍-铁氢化酶和固氮酶。

和梭状芽胞杆菌暗发酵和球形红菌光发酵产氢不同，这些酶相互作用是氢生产的关键。

1、梭状芽胞杆菌

梭状芽胞杆菌产氢酶不通过固氮酶，而是依靠铁-铁氢化酶，铁-铁氢化酶的活性是镍-铁氢化酶的100倍，是固氮酶的1000倍，催化中心是铁-铁电子供体和受体。梭状芽胞杆菌的镍-铁氢化酶可以氧化氢气，能利用氢气提供电子维持细胞代谢。

梭状芽胞杆菌能将葡萄糖降解为丙酮酸和NADH，丙酮酸进一步被丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶和还原型铁氧还蛋白转化为乙酰CoA和氢气，乙酰CoA继续转化为醋酸、丁酸和丙酸。醋酸发酵过程1摩尔葡萄糖最多能产生4摩尔氢气。丁酸发酵过程只有一半的产量。混合培养梭状芽胞杆菌可同时产生醋酸、丁酸和丙酸。养梭状芽胞杆菌发酵de副产品有机酸，可以被球形红菌作为底物利用。

2、球形红菌

非硫紫球形红菌（PNS）能在有光条件下，利用多种有机物，特别是有机酸制造氢气。光发酵系统分无氧(PS-I)和有氧(PS-II)两类， PS-I需要有机酸。在不产氧光合作用下，因为不会遭受氧气的抑制作用，系统可持续裂解水产生氢气。

PNS细菌产生氢气的酶是固氮酶，虽然也有氢化酶，但铁-铁氢化酶产生的氢气全部都被镍-铁氢化酶消耗（10倍）。只有在氮缺乏条件下，固氮酶的活性才能超过氢化酶对氢气的消耗，系统才能产生氢气。

球形红菌光合作用复合物PS-I是主要吸光结构，PS-II则可以产生氧气，这会抑制氢气产生，因此必须保持系统内的低氧分压。PNS菌可以利用400-1000 nm的光线，这包括可见光和近红外线，不包括紫外线。蓝藻只能吸收400-700 nm的可见光。

为减少占地面积，产业化光发酵可用发光二极管作为光源。这可以有效避免发酵系统自限，用有效能源维持光合作用，造价相对低廉。但不可能所有光反应都使用人工光源，光转化产氢的最大转化率只有10%，而氢气发电的转化率只有80%，这会导致循环无法维持。为了获得净能量利润，太阳光是必须的。