基因组编辑技术是当前生物医学领域的明星技术，目前人们掌握的这类技术包括锌指核酸酶技术和后来的TALEN技术。从2012年后（最早2011年Nucleic Acids Research杂志刊载的Streptococcus thermophilus的CRjSPR／Cas系统），新的基因编辑技术CRIsPR／Cas9系统闪亮登场，预计将给生物医学带来巨大的影响。今年《科学》第一期（今天），发表两篇相关研究。预示着2014年将会成为CRIsPR／Cas9系统尽情表演的一年。

基因组编辑技术被《Science)评选为2012年的10大新闻之一，以“Genome Cruise Missiles”为标题名列第三。在以TALEN系统为主的文章里，在未来展望部分，均介绍了CRIsPR／Cas9系统。美国加州大学伯克利分校的Jennifer A．Doudna和瑞典优密欧大学的Emmanuelle Charpentier在2012年8月17日版《Science) (网络版201 2年6月28日刊出)上发表了题为“A programmable dua1．RNA—guided DNA endonuclease in adaptivebacterial immunity”的论文。利用cRISPR／Cas II型的CRISPR／Cas9系统设计RNA，此RNA成功地将Cas9导入目标DNA部位，表明CRISPR／Cas9系统与TALEN一样能在目标部位将DNA切割。2013年的《自然》和《科学》都不约而同把眼光共同投向新的CRISPR／Cas9系统。

1987年日本大阪大学（Osaka University）的科研人员们曾发表过一篇论文，这篇论文当时并没有引起太多关注，也只是一篇普通的小文章。大阪大学的科学家当时正对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究，他们发现，在该基因编码区域附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段由简单的重复序列组成，在片段两端还存在一段不太长的特有序列。

关于这样一个重复序列，他们当时并不了解其生物学意义。不过，这个三十年前取得不起眼的“小发现”，今天却绽放出耀眼的光芒。因为如今科学家们正是利用这个小片段找到一种可对多种生物基因组进行改造的工具，这种方法操作起来非常地简单。2013年《自然》将这种技术选为明星技术，并对这种技术的应用前景寄予厚望。2014年《科学》杂志第一期，就发表两篇使用该技术的新研究论文。

近年来，随着全基因组测序技术的不断成熟，在各种细菌和古细菌（archaea）中陆续发现了很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，即CRISPR序列，就是1987年前日本科学家发现的那个序列）和CRISPR相关基因（CRISPR-associated genes, Cas gene）。研究发现，这些CRISPR序列与很多病毒或者质粒的DNA序列是互补的，说明这套CRISPR–Cas系统很有可能是生物体抵御病毒等外来入侵者的一套特异性防御机制，就好像是另外一套适应性免疫反应系统（adaptive immune system）。目前已经清楚，细菌和古细菌在与噬菌体的生存斗争中，进化出了获得性免疫系统CRISPR，该结构能够通过其转录出的mRNA又称crRNA及CRISPR相关蛋白(Cas)，可对外来某一特定单链或双链DNA实施高特异性地沉默或降解。

很多CRISPR–Cas系统需要多种蛋白参与，但在很多细菌胞内只需要一种内切酶endonuclease（Cas9）就足够，这种CRISPR–Cas系统被称作2型系统（type II systems）。Cas9内切酶在向导RNA指引下，能够对各种入侵的外源DNA分子进行定点切割，主要识别的是保守的间隔相邻基序（proto-spacer adjacent motifs，PAM基序）。要形成一个有功能的DNA切割复合体，还需要另外两个RNA分子帮助，它们就是CRISPR RNA (crRNA)和反式作用CRISPR RNA（tracrRNA)。后来研究发现，这两种RNA可被“改装”成一个向导RNA（single-guide RNA, sgRNA）。这个sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割。随后在多种细胞和生物体内，这种经过改造RNA介导Cas9酶能够发挥功能，在完整基因组特定位点完成切割。这样就能方便地进行后续基因组改造了。细胞通常会通过两种方式对发生双链断裂的DNA进行修复，这两种方式分别是同源重组修复机制（homologous recombination, HR）和非同源末端连接修复机制（non-homologous end joining, NHEJ），在修复过程中细胞有可能会对修复位点进行修饰，或者插入新的遗传信息。

作为基因组编辑技术，大约10年前就开发了锌指核酸酶(ZFN)，但很难任意切割基因组序列(能对应的序列是有限的)。其使用价格也很高，妨碍了该技术的普及推广。继这之后开发出的是TALEN，能够设计出对应目标序列中某个碱基对的蛋白质，20 1 2年其应用得到了迅速的普及。

但与TALEN相比，CRISPR／Cas9的缺陷是特异性不强，容易产生毒性，这个问题比形象地比喻为脱靶现象。CRISPR／cas9系统的引导RNA有20个碱基，含有不能用来识别目标碱基的碱基部分，实际上，能使之具有特异性的、可利用的只有约1 5个碱基，能设计出的多样性理论上可以达到4的15次方。另一方面，在TALEN系统中，可利用执行切割的剪刀两侧各有的16个碱基来设计特异性，特异性为(4的16次方) ，所以很容易确保目标切割特异性。如果不能在目标部位切割，就容易因脱靶(off-target)产生毒性。

 http://www.bio360.net/news/show/8285.html

Shalem_O_Science_2013[1].pdf