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小鼠胰腺腺泡细胞系MPC-83中功能性G蛋白偶联受体的缺失

已有 4622 次阅读 2008-3-5 19:16 |个人分类:实验室最近论文|系统分类:科研笔记

小鼠胰腺腺泡细胞系MPC-83中功能性G蛋白偶联受体的缺失

 

程海立,王琳,崔宗杰*

[程海立 完成了图2-4的试验,王琳 完成了图1的试验。崔宗杰 负责项目的构思、试验工作的指导,和论文的定稿。]

 

北京师范大学细胞生物学研究所,北京100875

 

国家自然科学基金资助项目,No. 30472048No. 3054042524

北京市自然科学基金资助项目,No. 6062014

 

*通讯作者:北京师范大学细胞生物学研究所,北京100875

电话:010 5880 9162

E-mail: zjcui@bnu.edu.cn

 

收稿日期2007915      接受日期2007101

 

摘要

目的:正常啮齿类胰腺腺泡细胞典型地含有M3型胆碱能受体、CCK1型胆囊收缩素受体等G蛋白偶联受体(GPCR)。本论文研究小鼠胰腺肿瘤细胞系MPC-83细胞中是否存在功能性GPCR方法:培养小鼠胰腺肿瘤细胞系MPC-83细胞,检测其刺激前后胞浆游离钙离子浓度的变化。结果:实验发现,ACh 25 nmol.L-1刺激新鲜分离的正常小鼠胰腺腺泡细胞,胞浆钙离子浓度发生规则、振荡样升高;CCK 5 pmol.L-1具有类似作用。GPCR激动剂CCK 1 μmol.L-1VP 1 μmol.L-1P 物质5 μmol.L-1、组织氨10 μmol.L-1PE 10 μmol.L-1ACh 100 μmol.L-1分别刺激MPC-83细胞,胞浆钙离子没有发生任何增加。地塞米松 100 nmol.L-1 MPC-83细胞共孵育72 h,发现:MPC-83细胞增殖速度明显降低,但是上述GPCR配体CCK 1 μmol.L-1VP 1 μmol.L-1P 物质5 μmol.L-1仍然不引起胞浆钙离子浓度的增加。结论:这些试验说明,从昆明小鼠胰腺外分泌部分离出来的胰腺腺泡细胞系MPC-83,正常的G蛋白偶联受体完全缺失,处于极度去分化状态。

关键词:胰腺腺泡细胞,GPCR,胞浆钙离子浓度,Fura-2, 去分化,MPC-83细胞

Complete loss of functional G protein-coupled receptors in mouse pancreatic acinar cell MPC-83

 

Hai Li Cheng, Lin Wang, Zong Jie Cui*

 

Institute of Cell Biology, Beijing Normal University, Beijing 100875

 

Supported by grants from NSF China No. 30472048No. 3054042524 and from NSF Beijing No. 6062014.

 

*Corresponding author: Institute of Cell Biology, Beijing Normal University, Beijing 100875

Phone: 010 5880 9162

E-mail: zjcui@bnu.edu.cn

 

Abstract

Aim: It is now established that M3 muscarinic acetylcholine receptors and CCK1 cholecystokinin receptors are among the major secretagogue receptors in normal exocrine pancreatic cell secretion. The aim of this work was to investigate whether such functional GPCR receptors exist in the Chinese made mouse exocrine pancreatic acinar cell line MPC-83. Methods: Cytosolic calcium concentration in mouse exocrine pancreatic acinar cell line MPC-83 was measured both before and after stimulation with GPCR agonists. Results: It was found that ACh 25 nmol.L-1 and CCK 5 pmol.L-1 induced regular calcium oscillations in freshly isolated normal mouse pancreatic acinar cells. GPCR agonists CCK 1 μmol.L-1VP 1 μmol.L-1substance P 5 μmol.L-1histamine 10 μmol.L-1PE 10 μmol.L-1 and ACh 100 μmol.L-1 when added to MPC-83 cells, no change in intracellular calcium concentration was detected. After dexamethasone 100 nmol.L-1 pre-treatment of MPC-83 cells for 72 h, MPC-83 cell proliferation was reduced, but still no calcium increases were detected after stimulation with GPCR agonists CCK 1 μmol.L-1VP 1 μmol.L-1 and substance P 5 μmol.L-1. Conclusion: These data indicate that MPC-83, the pancreatic acinar tumor cell line from QunMing mice, have completely lost their functional GPCR which are normally present in pancreatic acinar cells; and these cells are poorly differentiated.

Keywords:  Pancreatic acinar cells, GPCR, calcium oscillation, MPC-83

 

0 引言

胰腺腺泡细胞合成、分泌多种消化酶如淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂酶、核酸酶[1]。消化酶/酶原的合成和分泌受到胰腺腺泡细胞表面多种G蛋白偶联受体(GPCR)的调控,如CCK1受体、M3受体、P物质受体[2]。刺激新鲜分离的胰腺腺泡细胞表面的GPCR,可以得到接近在体状态的消化酶分泌水平[3]。但在实际工作中,往往也需要可传代的、近似生理状态的胰腺腺泡细胞系。

目前ATCC收录的胰腺外分泌细胞系有6种,分别是PANC-1SW 1990ARIPDSL-6A/C1DSL-6B/C2AR4-2J[4]PANC-1SW 1990来自人[5, 6],其余4种来自大鼠[7, 8];没有来自小鼠的胰腺外分泌细胞系。6胰腺外分泌细胞系中,SW 1990是由脾转移的肿瘤细胞,PANC-1DSL-6A/C1DSL-6B/C2是胰腺导管细胞[5, 7]ARIPAR4-2J是大鼠胰腺腺泡肿瘤细胞系AR4-2J既有致瘤性,也能分泌淀粉酶和其它胰腺消化酶[8]。近年也有人认为ARIP具有导管细胞的特性[9]

AR4-2JLongnecker 等建立的,重氮丝氨酸诱导的,大鼠胰腺腺泡肿瘤细胞系[10]AR4-2J同时具有外分泌和神经内分泌细胞的特性[11],也可被诱导向胰岛细胞表型分化[12]。地塞米松(Dex, dexamethasone)处理后,AR4-2J的外分泌表型加强,胰岛内分泌表型减弱[13]Dex处理6 h后,淀粉酶分泌开始上升,细胞生长变缓[12, 14]

AR4-2J细胞典型地含有电压依赖性钙离子通道LPN[15]Ghrelin刺激AR4-2J细胞导致其胞内钙离子浓度的双相增加,L型钙离子通道在第二相中具有关键作用[16]CCK刺激AR4-2J,诱发钙振荡的出现[17],和淀粉酶的分泌[18]。植物血凝素抑制CCK-8AR4-2J细胞CCK受体的结合[19]

我国科学家建立的小鼠胰腺腺泡肿瘤细胞系MPC-83,来自1983年发现的一例雄性昆明种小鼠胰腺自发瘤[20-22]MPC-83细胞可在小鼠皮下连续传代220[21]MPC-83细胞,在浆胞含酶原颗粒,和丰富的脂酶颗粒[21]MPC-83皮下移植传代后仍然具有胰腺腺泡细胞消化酶活性[22]。研究发现MPC-83可作为生物反应调节剂(BRM)抗肿瘤实验研究的细胞模型[23]

AR4-2J系后到目前为止,AR4-2J为研究对象的论文超过 1000 篇。但是对MPC-83细胞基本特性的研究,尚鲜见报道。因而本工作的目的是,研究MPC-83细胞是否存在相关的功能性GPCR

正常胰腺腺泡细胞表面最主要分泌刺激物(secretagogue)受体是CCK1受体和M3受体。两种都通过Gq/11PLCβ信号系统偶联[2],低浓度AChCCK刺激引发胞内游离钙离子浓度的振荡性升高[3, 24-26]。随着AChCCK刺激浓度的增加,钙离子浓度的振荡性升高逐渐转换为高台样升高[3, 26, 27]。这种浓度依赖性变化在其它细胞也普遍存在,如淋巴细胞、肝细胞、成纤维细胞和胰岛β细胞[28]。所以本文通过检测胞浆钙离子浓度的升高,来判断MPC-83细胞是否具有相关的功能性GPCR

1 材料与方法

1.1 材料

胆囊收缩素八肽(CCK-8)、血管加压素(VP)、苯肾上腺素(PE)、乙酰胆碱(ACh)、P物质(substance P)、组织胺(histamine)胰蛋白酶(trypsin)均为美国Sigma-Aldrich公司产品。Fura-2 AM为美国Molecular Probes (Eugene, OR)公司或AnaSpec (San Diego, CA, USA)产品。4-(2-Hydroxyethyl)-1–piperazineethane -sulfonic acid (HEPES)为德国Boehringer Mannheim公司产品。

小鼠胰腺腺泡肿瘤细胞系MPC-83购自协和医科大学肿瘤研究所细胞室,用含10%胎牛血清(FBS, Hyclone)RPMI 1640培养液,在5CO2培养箱中37oC培养。MPC-83细胞传代开始时1天换培养液1次,长至50%以上闭合度后,至少每12 h换液一次。培养所用RPMI 1640培养基(Invitrogen),配制时加入HEPES 10 mmol.L-1,青霉素和各链霉素100 U/LNaHCO3 2 g.L-1, pH7.2。细胞传代时用0.25%胰酶/EDTA 0.53 mmol.L-1消化。细胞冻存时成份为60RPMI 164030FBS10DMSO

1.2 方法

正常胰腺腺泡的分离见文献报道[3, 26]。分离腺泡细胞用胶原水解酶P (Roche)和机械吹打,分离后用150线的尼龙网或不锈钢网过滤。消化后残留的胶原水解酶,通过在含有4% 牛血清白蛋白(BSA)的缓冲液中离心而去除。

1.2.1 细胞胞浆钙离子浓度的测量

细胞用Fura-2 AM (终浓度5 µmol.L-1)加载1 h,在单细胞钙离子测量系统(DelatRam V, Photon Technology Incorporation, New Jersey, USA)的倒置荧光显微镜(Olympus IX70)下,检测细胞胞浆钙浓度的变化。单色仪交替以340 nm / 380 nm波长激发Fura-2, 采集荧光发射波长> 510 nm, 钙离子浓度以荧光强度比F340 / F380 表示。实验过程中用缓冲液灌流细胞15-20分钟,记录静息状态下的钙离子浓度的基础值,之后灌流含不同浓度刺激物的缓冲液,刺激细胞。灌流细胞用缓冲液成份如下(mmol.L-1)NaCl 118KCl 4.7CaCl2 2.5MgCl2 1.13NaH2PO4 1.0D-葡萄糖 5.5HEPES 10pH7.4,充氧30 min后使用。试验过程中通过Felix32软件(Photon Technology Incorporation, New Jersey, USA)自动得到以荧光强度比值F340/ F380为纵坐标,时间为横坐标的钙离子浓度随时间动态变化图。数据后期处理使用SigmaPlot软件重新做图和标注。

1.2.2 Dex处理

对于形态学实验,首先用Dex 100 nmol.L-1处理三天,之后将对照和Dex 100 nmol.L-1处理过的MPC-83细胞在盖玻片爬片,12 h后细胞贴壁,加载MitoTracker (100 nmol.L-1) 1 h。加载MitoTracker的细胞在FV300 (Olympus, Japan)激光共聚焦显微镜(IX70, Olympus, Japan)成像。对于细胞增殖实验,将细胞在24孔培养板接种,在平行孔中分别接种细胞后,对照细胞加正常培养基,实验组加含Dex 100 nM的培养基。在不同时间将细胞用胰酶消化后记数。每组实验都进行平行3组实验。细胞记数后用SigmaPlot做图,绘制细胞生长曲线,细胞数以mean ± SE表示。细胞生长曲线中细胞数目的差异用Student’s T检验进行统计学分析,P < 0.05时为差异显著。

2 实验结果

2.1 AChCCK在新鲜分离的正常小鼠胰腺腺泡细胞引发规则钙振荡

新鲜分离的正常小鼠胰腺腺泡细胞,经ACh 25 nmol.L-1刺激后,出现规则的钙离子浓度的振荡样增加;CCK 5 pmol.L-1刺激也出现规则钙振荡(1)。这些结果说明,在正常的新鲜分离的小鼠胰腺腺泡细胞,分泌刺激物(secretagogue) AChCCK都引发规则钙振荡;显示在正常细胞,存在功能性的胆碱能和CCK受体(1)

2.2 不同GPCR配体对小鼠胰腺腺泡肿瘤细胞MPC-83胞浆钙离子浓度的影响

为了验证在培养的MPC-83细胞,是否存在胆碱能和CCK受体,首先用CCKACh 刺激MPC-83细胞。低浓度ACh 25 nmol.L-1CCK 5 pmol.L-1没有任何作用(结果未显示);当浓度分别增加到ACh 100 μmol.L-1CCK 1 μmol.L-1,也没有发现胞浆钙离子浓度的明显增加(图2AB)。其它GPCR受体激动剂P物质 5 μmol.L-1、组织胺10 μmol.L-1phenylephrine (PE) 10 μmol.L-1vasopressin (VP) 1 μmol.L-1高浓度刺激,钙离子浓度也都没有发生明显变化(图2CDEF)。其中在一个细胞,ACh刺激后有轻微增加(图2B);但是在后续的两次试验中,这一增加也没有重复出现。

2.3 细胞促分化剂DexMPC-83细胞的作用

已知在大鼠胰腺腺泡细胞系AR4-2J,糖皮质激素Dex处理后,细胞趋于进一步分化的状态;细胞酶原颗粒增加[14, 29]。因而在本试验中,MPC-83细胞也用Dex进行了处理。用含有Dex 100 nmol.L-1 RPMI 1640培养基,培养MPC-83细胞72 h后,发现MPC-83细胞对CCK 1 μmol.L-1ACh 100 μmol.L-1P物质 5 μmol.L-1仍然没有任何反应(3 ABC)。这些结果揭示,糖皮质激素DexMPC-83细胞,不能有效诱导CCKAChP物质受体的表达。从形态学上来看,Dex处理后,细胞没有发生明显变化。MitoTracker荧光成像发现,MPC-83细胞胞浆充满线粒体(图4A);Dex处理后,线粒体有增多的趋势(图4A)。MPC-83细胞的生长曲线呈典型的S型曲线;Dex处理后,生长曲线明显变缓,细胞生长速度从第48小时开始有显著差异(图4B)。

3 讨论

本项工作研究昆明小鼠胰腺腺泡细胞肿瘤来源的细胞系MPC-83,可能存在的G蛋白偶联受体。研究发现:1/ MPC-83细胞用AChCCKP物质、组织胺、VPPE刺激都没有引发胞浆钙离子浓度的变化;2/ Dex 100 nmol.L-1处理72 hAChCCKP物质仍然没有反应;3/ Dex处理后,MPC-83细胞整体形态没有明显变化,但是线粒体密度有增加的趋势;4/ Dex处理后,MPC-83细胞生长速度明显变缓;5/ 作为对照,低浓度的AChCCK在新鲜分离的正常小鼠胰腺腺泡细胞,可以诱发出规则钙振荡

已知CCK在生理浓度(5-50 pmol.L-1)可引发新鲜分离的啮齿类胰腺腺泡细胞产生规则钙振荡,> 50 pmol.L-1引发[Ca2+]i 的高台样升高[3, 26, 27]ACh 也具有类似的浓度依赖关系,纳摩尔水平(25 nmol.L-1)ACh,就可以有效诱导啮齿类胰腺腺泡细胞中钙振荡的出现;更高浓度导致钙离子的高台样升高[3, 26, 27]AChCCK分别通过M3型胆碱能受体和CCK1CCK受体,发挥作用[25]。在本试验中,刺激MPC-83细胞的AChCCK浓度分别增加到100 µmol.L-11 µmol.L-1后,MPC-83细胞仍然没有钙离子浓度的明显升高。这说明在MPC-83细胞,不存在功能性AChCCK受体。同样,高浓度的G蛋白偶联受体激动剂VPP物质、组织胺和PE,也不刺激MPC-83细胞胞浆钙离子浓度的明显增加。在所有实验,实验结束后蒸馏水灌流,都导致胞浆钙离子的大幅增加(没有显示),说明MPC-83细胞存在水通道。综合考虑以上实验结果,昆明小鼠胰腺腺泡细胞系MPC-83,不含功能性G蛋白偶联受体,细胞处于高度去分化状态。

肿瘤细胞增殖迅速,使细胞的原有功能受到抑制。肿瘤细胞增殖越快,其分化程度越低。MPC-83细胞生长旺盛,用含胎牛血清10%的RMPI 1640培养基培养,细胞需12 h换液一次,两天可传代一次。检测MPC-83细胞静息状态下胞浆钙离子浓度的试验证实,对细胞进行灌流,胞浆钙离子浓度保持不变。但是在1次试验中(6),记录到细胞的自发钙振荡(结果没有显示)

在重氮丝氨酸诱导的大鼠胰腺腺泡肿瘤细胞AR4-2JDex处理抑制AR4-2J细胞的增殖,但是细胞的淀粉酶含量增加,Dex有效促进AR4-2J向外分泌表型分化[29, 30]。在本实验中,用Dex 100 nmol.L-1处理MPC-83细胞,处理过的细胞对CCKAChP物质的刺激仍然没有任何反应。

Dex处理MPC-83细胞72 h后,处理细胞与正常细胞比较,线粒体密度有明显增加。生长曲线比较显示,Dex处理过的MPC-83细胞,其增殖速度明显变缓。说明和AR4-2J一样,Dex能够抑制MPC-83细胞的增殖,并促进其分化。

至于MPC-83细胞为何不含功能性的G蛋白偶联受体,将来需要进行更加深入的研究。有几个可能:G蛋白偶联受体得到表达,但是所偶联的G蛋白、或磷脂水解酶C缺失,或者GPCR-G-PLC都存在,但是钙离子信号系统的相关蛋白如IP3RSERCA/PMCA缺失。尽管如此,MPC-83细胞可能具有AR4-2J细胞所不具备的优点。MPC-83细胞没有内源性的胰腺腺泡细胞促分泌(secretagogue)受体,因而这一细胞系可以用来表达外源性的G蛋白偶联受体,并研究这些外源表达的受体,如何随着表达程度的变化调控细胞消化酶的分泌。也可用MPC-83细胞来重构胰腺腺泡细胞的钙离子振荡系统,分析钙振荡发生的分子基础。

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图例

1. AChCCK在正常小鼠胰腺腺泡细胞诱发胞浆规则钙振荡。A: ACh 25 nmol.L-1B: CCK 5 pmol.L-1。横条表示给药时间,每个记录是3次相同试验的典型结果。

 

2. CCKAChP 物质、组织胺、PEVP等受体激动剂刺激MPC-83细胞后,胞浆钙离子浓度没有明显增加。横条表示给药时间,每个记录是3次相同试验的典型结果。

 

3. CCKAChP物质刺激Dex处理后的MPC-83细胞,胞浆钙离子浓度没有增加。Dex 100 nmol.L-1处理MPC-83细胞72 h后,CCKAChP物质刺激细胞,记录细胞胞浆钙离子浓度的变化。横条表示给药时间,图中每个记录代表3次实验的典型结果。

 

4. Dex 处理对MPC-83 细胞形状和增殖的影响。A. Dex 100 nmol.L-1 加入MPC-83细胞培养液72 h后,加载MitoTracker,分别将对照细胞(a, b, c)Dex处理过的细胞(d, e, f)进行共聚焦成像。其中ad是明场图,be为荧光图,cf是明场和荧光的叠加图。B. Dex 100 nmol.L-1MPC-83细胞增殖的影响。没有加Dex和加Dex的细胞,每隔12 h各取三孔计数,绘制生长曲线。* 表示与对照细胞相比,差异显著(P < 0.05)


 

 

Figure 1

 

 

Figure 2

 

Figure 3

 

 

4A

4B

a

b

e

d

c

f

 

Figure 4

论文的PDF文挡

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