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[转载]冰冻切片

已有 3043 次阅读 2011-5-24 22:11 |系统分类:科研笔记|关键词:水合氯醛,冰冻,切片,PFA| 冰冻, 切片, 水合氯醛, PFA |文章来源:转载

1.动物牺牲前先注入得以安乐死剂量的麻醉药(水合氯醛等)
2.开胸,使用4%PFA灌流(先将针头插入右心室,将左心房剪开)
3.灌流成功肝颜色会由红转白,PFA则会使尸体抖动僵硬
4.取下组织,并浸泡4%PFA 24小时
5.用10%或30%蔗糖脱水
6.使用OCT包埋,并隔着2-甲基丁烷液氮冷冻
7.上机切片10μm方便观察,30μm适合进行confocol z section
8.切完不立即使用,请置入-20°C冰箱,切片要在两周内使用。
 
附:4%PFA的配制
4%PFA较适于光镜免疫细胞化学研究,最好是动物经灌注固定取材后,继续浸泡固定2~24h。另外,该固定剂较为温和,适于组织标本的较长期保存。
多聚甲醛          40g
0.01M磷酸缓冲液           至1000ml
  配制方法:称取40g多聚甲醛,置于三角烧瓶中,加入500~800ml 0.01M磷酸缓冲液(Phosphate Buffer以下简称PB),加热至60℃左右,持续搅拌(或磁力搅拌)使粉末完全溶解,通常需滴加少许1N NaOH才能使溶液清亮,最后补足0.01M的PBS至1000ml,充分混匀。
 


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