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FlowJo分析钙离子流量

已有 6909 次阅读 2012-9-28 15:52 |个人分类:FlowJo使用|系统分类:科研笔记|关键词:钙离子流量,流式,数据分析,FlowJo| 数据分析, FlowJo, 流式, 钙离子流量

FlowJo分析钙离子流量
作者:蔡何青,FlowJo 技术专员

一、原理

钙离子是机体的重要元素,同时作为细胞内第二信使通过与钙调蛋白(Calmodulin,CaM)结合激活多种蛋白激酶(如腺苷酸环化酶、磷酸二酯酶、钙调蛋白激酶等)及诸多蛋白水解酶和核酸酶,从而参与包括细胞代谢、细胞周期等多种细胞功能的调节,在细胞的许多生命活动中担当着重要的角色。因此,钙离子测定在医学实验研究中有着重要意义。

钙离子流量可以用多种实验方法监测,其中流式细胞技术监测钙离子是一种简单方便准确的方法,得到了很多应用。实验中,需要分析细胞内钙离子含量随时间变化的曲线。在流式采集的过程中,需要采集“Time”参数,在开始的1~2分钟内采集未刺激细胞的钙离子含量数据,然后加入刺激并采集刺激后的数据。实验的目的是为了测量刺激之后,细胞内钙离子含量随时间变化的过程,比较不同样本之间或者不同刺激之间钙离子含量变化的差异。

具体的监测方法,请查看其它文献,此博文着重于采集钙离子流量流式数据之后,如何分析的问题。

图A:X轴为“Time”(单位为秒),Y轴为钙离子含量参数(这个例子中为Indo Ratio),图中记录了整个持续时间内所有细胞的钙离子含量。图A是在FlowJo图形窗口中选择伪色图显示的,我们只能从图中看出刺激之后,钙离子含量变化的一个大致趋势。中间断层是加药物刺激的时间。

在FlowJo的动力学平台“Kinetics”中可以进行其他的分析,比如查看median随时间变化的曲线,然后可以将不同样本之间的数据进行叠加比较。例如下面的图B和图C。

 
图B中,X轴为时间,Y轴为荧光强度的中位数(median)。显示的是每一个时间点的细胞荧光强度的中位数,能够反映出刺激之后,细胞内钙离子含量随时间变化的趋势,而且可以在Layout布局编辑器中将不同样本之间的趋势图叠加在一起进行比较。除了median之外,Y轴还可以选择mean、geometry mean、percentile

图C中,Y轴为“% Cells > Threshold”,显示的是:在某个时间点荧光强度大于阈值的细胞所占的百分比,比如在200秒的时候有大约90%的细胞的荧光强度在阈值之上。选择这种显示方式的时候,需要设置一个阈值(Threshold)。

二、FlowJo分析钙离子流量的步骤
演示数据:Kinetic Tutorial Data
1. 设门分析,找到目标细胞群
2. 在工作台中选中目标细胞群,到“Tools”菜单栏里选择“Kinetics”,打开动力学分析平台。
 
3. 打开“Options”菜单
3.1 在Statistic中选择Y轴显示的统计数据:常用的为“median”或者“% Cells > Threshold”(下拉列表中的第5个),参考原理中的有关介绍
 
3.2 在Smoothing选项中选择曲线光滑的方式,可以对曲线进行光滑处理
 
4. 如果有需要,可以创建time-slice,也就是将整个变化曲线分成多个时间段,Kinetics平台能对每个时间段的数据进行统计。
创建time-slice有三种方式,可以手动创建,也可以让软件自动创建
 
创建time-slice之后,Kinetics平台如下图所示,在Statistics栏里生成了各个时间段的统计数据。

5. 结果输出:
表格编辑器:进行统计数据的输出
布局编辑器:图形叠加,图形输出等
在具体的数据分析过程中,经常需要将不同样本的钙离子流量图叠加在一起,以便看出样本间的差异,比如下面的文献例子中的图。
下面的例子中,需要将M1、M2、Naive细胞的钙离子流量图叠加在仪器,步骤如下:
 
1) 点击按钮,打开布局编辑器
2) 在工作台中,选中M1细胞群的“Kinetics”节点并将其拖进布局页,
 
3) 在工作台中,选中M2细胞群的“Kinetics”节点,将其拖到布局页中M1细胞群的图形上方,松开鼠标后二者重叠在一起
 
4) 同样的步骤,将工作台中Naive细胞群的“Kinetics”节点拖入布局页,得到所需要的重叠图。
如果需要更改图形的长宽比例,先选中图形,选中图形的右下角并拖动鼠标,调整图形的宽高比,如下图所示:

5) 图片保存:点击按钮,选择文件保存的路径,并给文件命名。


三、文献例子
下图中比较了不同样本中的钙离子流量变化情况。
 
文献中引用FlowJo的描述:
Intracellular calciumconcentration was determined using the FlowJo kinetic function.
图片来自于:
Julie Zikherman. 2009. PTPN22 Deficiency Cooperates with the CD45 E613R Allele toBreak Tolerance on a Non-Autoimmune Background. The Journal of Immunology



http://blog.sciencenet.cn/blog-349948-617550.html

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