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FlowJo软件荧光补偿
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FlowJo软件荧光补偿
作者：蔡何青，FlowJo 技术专员
在做多色流式实验的时候，荧光补偿是必需必须进行的步骤。FlowJo可以根据荧光补偿单染对照管的数据生成补偿矩阵，并可以对补偿矩阵进行调整。
一、用FlowJo做荧光补偿并进行数据分析的步骤
1.在补偿编辑器中导入单染管的数据并生成荧光补偿矩阵
2.将补偿矩阵应用到组，对组里面的所有数据进行荧光补偿
3.对补偿过的参数轴启用双指数转换功能
二、FlowJo荧光补偿的具体步骤
如果荧光补偿单染对照的数据很好，阴性细胞群和阳性细胞群的分群很明显，只需要将单染管的数据导入FlowJo的补偿编辑器里，FlowJo能自动设门，界定出阴性细胞群和阳性细胞群，并计算出荧光补偿矩阵。操作非常简单，下面的4个步骤便可完成荧光补偿：
1.将数据拖入FlowJo工作台。
演示数据为：3 color comp数据，为三色实验的数据。Cy5PE comp.fcs, FITC comp.fcs, PE comp.fcs为单染对照管数据；3-COLOR.FCS为样本数据，同时染了Cy5PE, FITC, PE
2.到工作台菜单栏的“窗口”栏选择“打开补偿编辑器”，打开后如下图所示。点击单染管对应的Sample列，在弹出的下拉列表中选择对应的单染管数据。比如在下图的例子中，在Flour单染管中导入FITC comp.fcs
3.按照步骤2中的方法，在3个单染管中都导入对应的数据之后，FlowJo能自动进行设门，界定出阳性细胞群和阴性细胞群，并计算出荧光补偿矩阵。如下图所示：
4.将补偿矩阵应用到所有样本进行荧光补偿：在工作台的组空间中选中需要进行荧光补偿的组，到补偿编辑器的菜单栏中选择“补偿 > 添加到组”，
对该组的所有数据进行荧光补偿，补偿过的数据前面带有
标志，如下图所示：
标志，如下图所示：
如果某个单染管的数据不是很理想(poor control )，FlowJo不能自动界定出阴性细胞群和阳性细胞群，比如下面的实例：
操作步骤：
1.按照上面的步骤1,2,3操作之后，出现的情况如下：FlowJo没能自动界定出PE单染管的阴性细胞群和阳性细胞群。
1.1 单击选中工作台样本空间中PE单染管下的cw_Size节点，将其删除
1.2 右键单击补偿编辑器中的单染管出，点击“Clear”，将错误添加进去的单染管数据清除，如下图所示：
2.将错误界定的细胞群以及错误添加到补偿编辑器的数据清除之后，我们需要自己手动设门，界定出单染管的阴性细胞群和阳性细胞群，并手动将其添加到补偿编辑器。按以下步骤操作：
2.1 在工作台样本空间中双击PE单染管，在FSC/SSC点图中，界定出目标细胞群（淋巴细胞）
2.2 双击淋巴细胞群，打开图形窗口，X轴选择PhyEry::aCD8，Y轴选择Histogram ，选择区域门工具，界定出PE阳性和PE阴性细胞群，如下图所示：
备注：
a.在设门的时候，选择区域门工具，阴性门和阳性门尽量设在细胞群分布的中心区域
b.如果单染管的直方图没有明显的双峰，在设门的时候，阴性门和阳性门之间的距离应尽可能远一些
2.3 将工作台样本空间的“PE-”节点拖到补偿编辑器里PE单染管的阴性孔，“PE+”节点拖到阳性孔里
3.当所有单染管的数据都被添加到补偿编辑器后，FlowJo自动计算出补偿矩阵。在工作台组空间中选择3-color comp组，然后到补偿编辑器的菜单栏中选择“补偿 > 添加到组”，对该组的所有样本进行荧光补偿。
博文中用到的演示数据：3 color comp.rar
https://blog.sciencenet.cn/blog-349948-586332.html
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