6.TGF-β1通过转录调控促进肝脏Gln分解代谢

接下来，研究人员探究了TGF-β1是否会影响Glu水平。原代B细胞和A20细胞（小鼠B细胞淋巴瘤细胞系）中，TGF-β1处理不影响Glu水平，提示B细胞不是TGF-β1诱导Glu产生的主要来源（图S5L）。值得注意的是，TGF-β1处理可逆转muMT小鼠肝脏Gln含量的升高，同时降低血清Gln水平（图5A）。此外还可提高WT和muMT小鼠体内Glu水平（图5A）。与此一致的是，用B细胞条件培养基或TGF-β1培养处理人肝上皮（THLE）细胞和HepG2肝癌细胞，均降低了二者Gln生成并提高Glu水平（图5B和5C）。于是研究人员进一步研究TGF-β1信号对肝脏中GLS2/SLC7A5的靶向作用。令人惊讶的是，补充TGF-β1后，WT和muMT小鼠肝脏GLS2和SLC7A5的mRNA/蛋白质水平均显著上调，并完全恢复二者在muMT小鼠中的表达（图5D和5E）。

为了探究TGF-β1对GLS2/SLC7A5的调节作用以及肝脏Glu生成对运动表现的影响，研究人员建立了肝细胞特异性SLC7A5/GLS2双敲除（DKO）小鼠模型，该模型在其他组织中未出现脱靶表达变化（图S6A和S6B）。在该模型中，TGF-β1对GLS2和SLC7A5表达的影响完全消失（图5F和5G）。与muMT小鼠类似，DKO小鼠表现出肝脏Gln水平升高、血清Gln水平降低、骨骼肌Gln水平无明显变化，以及这三种组织中Glu水平降低（图5I和5J）。DKO小鼠还表现出运动能力受损以及骨骼肌CaMKII/p70S6K磷酸化水平降低（图5K和5L）。值得注意的是，TGF-β1的效应在DKO小鼠中几乎被完全消除（图5I-5L）。这些结果表明，DKO小鼠可重现B细胞缺陷引发的Glu代谢和运动表现变化，该过程可能依赖TGF-β1信号介导（小编注：肝脏中Gln的代谢分解主要包含两个过程，GLS2负责把Gln转化为Glu，SLC7A5等转运蛋白则将Gln从肝细胞运出去。在上文中，研究人员发现B细胞缺陷能下调肝脏GLS2和SLC7A5表达（图3K），为了证明B细胞通过GLS2/SLC7A5途径促进肝脏Gln分解代谢和逆向转运，接着在muMT小鼠中进行肝脏特异性过表达SLC7A5进行检测（图S4）。我们推测，由于肝脏中除了SLC7A5外还有多种Gln转运蛋白，为了证明SLC7A5的必要性，故须构建过表达模型进行检测。而GLS2是肝脏中分解Gln的唯一酶，不需要排除其他酶的影响，故研究人员没有专门对其进行检测。此处，研究人员想要探究TGF-β1对肝脏Glu的产生是否依赖于GLS2/SLC7A5这条通路，于是进行GLS2/SLC7A5双敲除，同时破坏肝脏生成和输出Glu的能力。如果只做SLC7A5单敲，可能存在TGF-β1上调GLS2或其他转运蛋白的情况，导致Glu代偿性产生，影响实验结果）。

接下来，研究人员探究了SLC7A5和GLS2是否为TGF-β1信号通路的直接转录靶点。为了研究蛋白质与DNA的相互作用（例如转录因子与基因启动子结合），研究人员通过核酸酶靶向切割和释放（CUT&RUN）-qPCR技术（小编注：ChIP-seq首先用甲醛将细胞内的蛋白与DNA交联固定，再将染色质随机打断为200-600bp的片段，然后通过抗体-磁珠免疫沉淀富集目标蛋白结合的DNA片段。该方法信噪比较高，所需细胞量较大，实验周期较长。CUT&RUN则首先将细胞或细胞核与目标蛋白的特异性抗体孵育，再加入Protein A/G与微球菌核酸酶（pA/G-MNase）的融合蛋白，使其与抗体结合，并把和目标蛋白结合的那段DNA切割下来，最后提取DNA进行qPCR或测序。相较于ChIP-seq而言，CUT&RUN可以精确定位蛋白结合位点，减少非特异性片段，分辨率可达单碱基级别。同时无需交联和超声破碎，信噪比更低。另外，这是在活细胞或完整细胞核内进行的，整个流程可在一天内完成，包括抗体结合、酶切和DNA释放），收集目标蛋白结合的DNA，通过qPCR对特定基因的启动子区域进行定量检测，判断目标蛋白是否在该区域富集及其富集程度。结果显示，与IgG对照组相比，SMAD2/3（TGF-β1主要的下游转录因子）在肝脏SLC7A5和GLS2启动子区域富集，且这种富集在muMT小鼠中减少（图5M），这与其血清TGF-β1水平较低相一致。TGF-β1治疗增强并恢复了muMT小鼠启动子区域中SMAD2/3的富集（图5M）。同时提高了抗CD20、muMT小鼠肝脏SLC7A5的表达，降低了血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的活性（图S6C-S6H）。此外，对ChIP-seq数据库的分析显示，在HepG2细胞中，SMAD2/3在GLS2和SLC7A5启动子区域富集，而在PANC-1（人类胰腺导管腺癌细胞系）、H1/H9胚胎干细胞（ESCs）、诱导多能干细胞（iPSC）WTC11和LX2细胞中，其富集程度存在差异（图S6I）。这些数据证实了SLC7A5和GLS2是TGF-β1的转录靶点，其表达受血清TGF-β1的调控（图5N）。

结合此前的研究成果，研究人员推论，B细胞通过TGF-β1介导的GLS2/SLC7A5上调来促进肝脏Glu生成（小编注：TGF-β1并非特异性调控肝脏代谢，还能作用于肝、肺、肾、心等器官，但文中没有对其他器官进行进一步检测。在本文中，研究人员发现B细胞可能通过某种信号分子来上调肝脏GLS2和SLC7A5，于是进一步探究B细胞相关趋化因子，发现血清中B细胞来源的TGF-β1发生显著变化。接下来通过CUT&RUN实验证明肝脏细胞GLS2和SLC7A5基因的启动子区域处于开放状态，允许TGF-β信号通路的下游转录因子SMAD2/3结合并激活其转录，进而证明B细胞通过TGF-β1介导的GLS2/SLC7A5上调来调控肝脏代谢。在这个过程中，研究人员只验证了TGF-β1对肝脏的调控作用，没有检测其他器官的TGF-β受体表达量以及被TGF-β1激活情况。对于心脏或肾脏，研究人员只证明了B细胞缺陷或运动不影响二者的Gln/Glu水平（图S4A-S4D）。对于骨骼肌，研究人员只证明了TGF-β1不影响小鼠骨骼肌TGF-β受体或下游Smads的基因表达（图S5C-S5E），表明TGF-β1不能直接调控骨骼肌。综上，我们认为B细胞产生的TGF-β1释放到血清中，能作用于肝脏在内的多种器官，但由于肝脏是机体氨基酸代谢的核心器官，只有肝脏的Gln/Glu水平发生显著变化，于是研究人员只证明TGF-β1对肝脏有调控作用，没有对其他器官进行探究），从而调节骨骼肌的功能。

图5.TGF-β1通过转录调控促进肝脏Gln分解代谢

图S6.TGF-β1对肝功能的影响及肌肉注射Glu恢复muMT小鼠运动表现

7.Glu通过激活骨骼肌钙信号通路增强机体运动能力

muMT小鼠中B细胞缺陷导致Glu水平降低，但对骨骼肌中潜在的Glu/Gln转运蛋白表达无显著影响（图S6J）。值得注意的是，直接肌肉注射Glu能恢复muMT小鼠的运动能力，并提高骨骼肌CaMKII和p70S6K的磷酸化水平，且对TGF-β1信号通路没有影响（图S6K-S6N）。这些发现表明，增加骨骼肌中的Glu含量能够增强运动能力。

接下来，研究人员探究了Glu是如何影响运动表现的。此前研究表明，Glu能诱发Ca²⁺信号发生变化，进而调控运动神经元的兴奋性和运动网络。研究人员推测钙/钙调蛋白信号传导可能是Glu调节运动过程中的必需条件。检测后发现，在静息状态和运动后，muMT小鼠腓肠肌（GAS）和胫前肌（TA）中Ca²⁺含量均减少（图6A）。为验证该效应是否由B细胞缺陷导致的血清Glu水平降低介导，研究人员用含不同B细胞数量的小鼠血清处理C2C12肌细胞，并检测其Ca²⁺反应。结果表明，高B细胞血清处理在电脉冲刺激（EPS）下增加了细胞内Ca²⁺瞬变水平（图6B）。一致的，细胞中CaMKII的磷酸化水平随血清B细胞数量的增加呈剂量依赖性升高（图6C）。Glu处理也增强了C2C12和原代肌细胞的Ca²⁺瞬变水平（图6D）和CaMKII磷酸化（图6E和6F）。在小鼠中，腹腔注射Glu增加了骨骼肌中的CaMKII磷酸化，并在抗CD20小鼠中基本恢复了这一水平（图6G）。相反，细胞可穿透性钙螯合剂AM-EGTA阻断了Glu诱导的肌管中CaMKII的磷酸化（图6H和S6O），进一步证实了Ca²⁺在Glu介导的骨骼肌功能中的重要性。

为了进一步探究Glu对骨骼肌功能的影响，研究人员评估了线粒体质量和生成情况。饲喂无Glu饮食的小鼠骨骼肌线粒体mtDNA拷贝数减少。而腹腔注射Glu后，mtDNA拷贝数显著增加，并缩小了WT与muMT小鼠之间的差异（图S7A）。同样，膳食补充Glu能恢复muMT小鼠骨骼肌线粒体功能相关基因的mRNA表达水平（图S7B），该效应同样存在于抗CD20小鼠中（图S7C和S7D）。同时，腹腔注射Glu可使muMT小鼠骨骼肌的线粒体数量恢复至正常水平（图S7E）。相比之下，补充Glu、B细胞缺陷或运动干预均不影响肝脏线粒体质量（图S7F-S7M），同时脾脏、心脏及肾脏的mtDNA拷贝数与线粒体功能相关基因表达也未发生改变（S7N-S7P）。

由于muMT小鼠骨骼肌TCA循环通量未发生变化（图3J）以及相关ATP数据（图6I），研究人员进一步探究了Glu是否能增强线粒体呼吸作用。对抗CD20和muMT小鼠骨骼肌中呼吸链组分基因的分析显示，细胞色素c氧化酶亚基NDUFA1、NDUFA2和NDUFA4的表达降低（图6J），这表明B细胞介导的骨骼肌Glu水平维持可能在维持线粒体呼吸作用中发挥作用。支持这一结论的是，直接向原代肌管和C2C12细胞补充Glu，可在不改变线粒体膜电位的情况下增加耗氧率（OCR）（图6K-6N）。这些数据表明，由Glu介导的线粒体呼吸作用支持骨骼肌的线粒体功能和运动表现，并且补充Glu能够恢复B细胞耗竭小鼠的运动表现（图2F）。

外周Gln很可能在肝脏中被分解为Glu，而过量的Gln可能刺激骨骼肌中Glu的生成，从而在一定程度上改善运动表现，如肝脏SLC7A5过表达实验所示（图S4H-S4J、S4L、S4N、S4P和S4Q）。因此，研究人员通过直接给小鼠补充Gln来进行验证。结果表明，抗CD20小鼠在补充Gln后，其血清和腓肠肌中Glu水平得以恢复（图S8A和S8B），运动表现也显著改善（图S8C）。同样地，补充Gln能够恢复骨骼肌的mtDNA拷贝数和线粒体数量（而不改变线粒体大小），并增加ATP水平（图S8D-S8G）。因此，补充的Gln可能是通过促进骨骼肌中Gln分解来发挥支持运动的作用。

这些研究结果表明，Glu能够激活Ca²⁺信号传导，并维持线粒体功能，从而提高运动能力。

图6.Glu能促进骨骼肌中的Ca2+信号传导和线粒体功能

图S7.运动或耗竭B细胞均不影响代谢组织中线粒体的数量或结构

图S8.补充Gln、Glu或TGF-β1均能提高抗CD20小鼠或muMT小鼠的运动能力

8.B细胞特异性敲除TGF-β1，可重现B细胞缺陷引发的肝脏代谢紊乱与运动能力下降

为了证实B细胞在运动及其相关机制中具有不依赖于免疫的作用，研究人员构建了B细胞特异性TGF-β1敲除小鼠模型（TGFB1floxp/+CD79ACre小鼠，以下简称TGF-β1小鼠）。该小鼠表现为TGF-β1表达降低，TGF-β2不受影响，同时脾脏和外周血单个核细胞（PBMC）中的B细胞数量正常（图7A、7B、S8H和S8I）。与muMT小鼠类似，TGF-β1小鼠也表现出运动能力、肌肉力量和耐力受损（图7C）。同时，血清和骨骼肌Gln水平降低，肝脏中Gln水平升高，并且这些组织中Glu水平均一致降低（图7D-7F）。另外，TGF-β1小鼠还表现出肝脏GLS2和SLC7A5表达显著降低，以及骨骼肌CaMKII和p70S6K磷酸化水平降低（图7G和7H）。但是，在补充Glu后能改善上述现象（图7B-7H）。这些发现表明，TGF-β1小鼠肝脏Glu代谢和骨骼肌功能与muMT小鼠相似。

接下来，研究人员从WT小鼠脾脏中提取B细胞，通过尾静脉注射移植到muMT小鼠体内。检测后发现脾脏中B细胞数量仅增加约20%（图7K、S8J和S8K），运动能力、血清TGF-β1水平以及肝脏中GLS2和SLC7A5表达均得到显著增强（图7I-7N、S8L和S8M）。同样，移植WT型B细胞增加了肝脏Gln含量，降低了血清和骨骼肌Gln含量，并提高了这些组织中Glu水平（图7O-7Q）。此外，骨骼肌中CaMKII和p70S6K磷酸化水平也有所增加（图7R）。这些发现证实了B细胞通过TGF-β1在肝脏和骨骼肌之间建立了代谢联系。

接下来，研究人员验证了肝脏Glu代谢的重要性。肝细胞特异性SLC7A5/GLS2双敲除（DKO）会加剧B细胞缺陷对小鼠运动表现以及肝脏、血清和骨骼肌Glu水平的影响（图S8N-S8Q），降低骨骼肌中的CaMKII和p70S6K磷酸化水平（图S8R），同时还会逆转补充TGF-β1对上述现象的改善效果。值得注意的是，B细胞缺陷和SLC7A5/GLS2双敲除导致的不良效应均可通过补充Glu得到显著改善（图S8N-S8R）。此外，补充Gln能够恢复DKO小鼠的运动能力、骨骼肌Glu水平、线粒体质量以及CaMKII/p70S6K磷酸化水平（图S9A-S9H），这与Gln分解为Glu以支持运动能力的观点一致（图S8A-S8C）。

综上，这些发现表明B细胞具有不依赖于免疫的功能，能通过调控肝脏代谢改善运动表现。

图7.B细胞特异性TGF-β1敲除会导致与B细胞缺陷类似的表型

图S9.补充Gln可改善DKO小鼠的线粒体功能和运动能力

9.CD⁴⁺和CD8⁺ T细胞耗竭不影响运动表现，且B细胞的调控作用无性别差异

研究人员耗竭小鼠CD4+和CD8+ T细胞，发现不影响其运动表现（图S10A-S10C）。有趣的是，B细胞缺陷导致雌性小鼠体重增加，而不影响雄性小鼠（图S1D）。在排除体重因素后（小编注：推测应该是采用协方差分析（ANCOVA）来排除体重对运动能力的影响。首先分别拟合WT和muMT两组小鼠的体重与运动能力，验证两组的斜率没有显著差异（即体重的影响在WT和muMT小鼠中是一致的），接着再将两组小鼠的体重与运动能力拟合出一条公共回归直线，估计出体重对运动能力的平均影响大小（即回归斜率）。对于每一只小鼠，根据它的实际体重与总平均体重的差值以及公共斜率，对其运动能力值进行校正。具体而言，体重大于平均者减去一部分以去除体重优势，体重小于平均者加上一部分以补偿体重劣势，从而得到“如果每只小鼠的体重都等于总平均体重时它应有的运动能力值”。最后，分别计算WT组和muMT组内所有小鼠校正后的运动能力平均值，即为两个组的校正均值。这个校正均值反映了在排除体重差异的干扰后，B细胞缺陷本身对运动能力的真实影响），检测发现muMT雌性小鼠的运动能力降低（图S10D），血清、肝脏和骨骼肌中Glu水平也降低（图S10E-S10G）。此外，muMT或抗CD20雌性小鼠的瘦体重减少、脂肪量增加，RE和EE降低且能量摄入不变，而补充Glu可有效逆转这些变化。结合雌雄小鼠的实验结果可知，B细胞调控运动能力的作用模式没有性别差异（图S10H-S10O）。

图S10.CD4+和CD8+ T细胞耗竭不影响运动表现，且B细胞的调控作用无性别差异Ca2+

总结

本研究发现，B细胞可通过非免疫途径调节小鼠运动能力。机制上，B细胞通过分泌TGF-β1，转录上调肝脏中的谷氨酰胺酶2（GLS2）和Gln反向转运蛋白SLC7A5，促进肝脏将Gln转化为Glu，维持外周Glu水平。进一步实验表明，循环Glu作用于骨骼肌，激活Ca2+振荡、CaMK信号通路和线粒体功能，最终增强运动能力。而补充Glu或TGF-β1，可以有效恢复B细胞缺陷导致的运动能力下降。

原文链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(26)00340-5

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