代谢学人

Cell  ：抑脂的风，还是吹到了肝脏~

撰文 | 夏志蕊 王颖雯 闪光余 朱丽君 刘爽 曹玉香

编辑 | 孟美瑶

校对 | 朱丽君

背景介绍

机体内的胆固醇稳态是一个复杂的代谢调控网络，其由多种组织协同调控，以维持膳食来源的胆固醇吸收、重新合成和胆汁清除、排泄之间的平衡。血液中胆固醇水平（尤其是低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)）的升高会促进动脉粥样硬化的发展，因此LDL-C被认为是心血管疾病(CVD)的重要危险因素。CVD是迫在眉睫的公共健康问题，全球有30%以上的死亡是与CVD相关的。膳食胆固醇和胆囊胆固醇均由肠细胞顶端表面的NPC1样(NPC1L1)蛋白吸收，并被包装成乳糜微粒释放到淋巴管中，最终进入体循环。乳糜微粒携带的甘油三酯(TGs)被外周组织水解和吸收，而乳糜微粒残留物则被胆固醇的主要合成部位——肝脏吸收。在肝脏中，不管是内源性合成还是外源性获得的胆固醇，都以包含载脂蛋白B (APOB)的极低密度脂蛋白（VLDLs）形式分泌到血液里，循环中的VLDL再进一步代谢为低密度脂蛋白（LDL），而LDL颗粒通过LDL受体(LDLRs)从血浆中清除。外周组织中过量的胆固醇可以以包含载脂蛋白A1（APOA1）的高密度脂蛋白(HDL)形式被运输回肝脏。此外，肝脏中多余的胆固醇则以游离胆固醇或胆汁酸(BAs)的形式通过胆汁分泌随粪便排出。

图 血浆脂蛋白的转运与转化

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胆固醇稳态

胆固醇稳态(Cholesterol Homeostasis)是有助于维持生物体内胆固醇内部平衡状态的机制。胆固醇是人体系统中一种重要的生物分子，可以在体内合成，并且受到高度调节，这种复杂分子的生物合成从乙酰辅酶A（乙酰CoA）开始，涉及近30种酶促反应。并且胆固醇具有多种生理功能，是合成胆汁酸、脂溶性维生素和甾醇类激素等生物活性分子的重要前体物质。胆固醇稳态发生紊乱在多种疾病的发展中起着关键作用，例如心血管疾病 （CVD）、神经退行性疾病和癌症，尤其是心血管疾病，其中脂质（主要是胆固醇酯）在内皮层下的巨噬细胞/泡沫细胞内的积累最终导致动脉粥样硬化病变的形成。有研究表明LDL渗入血管壁是导致动脉粥样硬化发生的驱动因素，内皮细胞上的一个受体—SR-B1能主动吸收血液中LDL，然后再将吸入的LDL从细胞的另一侧排出，使其在血管壁内积累。已知维持胆固醇稳态取决于胆固醇的生物合成、摄取、外排、运输、储存、利用/排泄，肝脏作为胆固醇代谢的中心器官，直接影响着机体全身胆固醇代谢稳态。

同时越来越多的研究表明，降低胆固醇水平，尤其是低密度脂蛋白胆固醇水平，可以有效保护心血管系统，预防心血管事件。现阶段他汀类药物被广泛用于降低血浆TC和LDL-C的水平，以预防或减少CVD。然而，他汀类药物存在副作用和不耐受，主要表现在肌病的临床表现包括肌痛、肌炎和横纹肌溶解。出现肌炎及严重横纹肌溶解的病例是比较罕见的，且多发生在合并多种疾病和联合使用多种药物的患者。横纹肌溶解常表现为CK（磷酸激酶）显著升高，可能伴有血肌酐升高，且常伴有肌球蛋白尿和肌球蛋白血症，并可引起急性肾衰竭，这使得研究人员不得不寻找更加安全可靠的药物，近期有研究发现非他汀类降胆固醇药物（例如依折麦布或PCSK9抑制剂）并与他汀类药物联合使用可能更有效地降低LDL-C水平。

参考文献：

[1] Duan, Yajun et al.Signal transduction and targeted therapy vol. 7,1 265. 2 Aug. 2022

[2]林洁,陈玉霞,章卫平.中国动脉硬化杂志,2022,30(9):737~743.

胆固醇的从头合成是一个消耗能量的过程，乙酰CoA在一系列酶的控制下合成胆固醇。其中，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)是限速酶，其活性在转录和转录后水平上均受到调控，甾醇调节元件结合蛋白(SREBP2)则是调控HMGCR及其他参与胆固醇合成和摄取基因表达的主要转录因子。胆固醇的生物合成和摄取是通过一种感知细胞胆固醇水平的负反馈机制来严格控制的。当细胞缺乏胆固醇时，SREBP2及其伴侣蛋白SREBP裂解激活蛋白(SCAP)借助外壳蛋白复合体II（COPII）从内质网运输到高尔基体，随后SREBP2在高尔基体中被蛋白酶依次切割位点1和位点2。SREBP2的N端结构域经切割后释放进入细胞核，在那里它作为转录因子增强参与胆固醇合成和摄取基因的表达。相反，当细胞胆固醇水平升高时，胆固醇与SCAP结合，触发其与胰岛素诱导基因(INSIG)的相互作用。这种相互作用将SREBP保留在内质网中，并阻止SREBP的激活和参与胆固醇代谢的基因的表达，从而有助于维持胆固醇稳态。尽管目前胆固醇水平对胆固醇稳态的调节已经被充分了解，但胆固醇以外的其他信号如何影响胆固醇合成仍然知之甚少。

小肠是胆固醇吸收的主要场所，当膳食中胆固醇含量增加时，小肠吸收胆固醇的量也会相应增加。然而，这种增加的吸收量会反馈性地抑制小肠自身的胆固醇内源合成，从而维持胆固醇的稳态。这是因为小肠细胞具有负反馈调节机制，当外源性胆固醇摄入增加时，它会降低自身合成胆固醇的需求。另一方面，肝细胞是胆固醇合成的主要场所，它们能够利用乙酰辅酶A等原料合成胆固醇。尽管膳食胆固醇对小肠胆固醇内源合成有抑制作用，并没有明显的证据表明其对肝细胞的胆固醇内源合成作用有抑制功能。猜测这是因为肝脏中的胆固醇合成受到多种因素的调控，包括激素、酶和营养状况等。

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胆固醇从头合成

所有哺乳动物细胞均能进行胆固醇生物合成，其主要定位于细胞膜，与相邻的脂质相互作用以调节双层膜的刚性、流动性和渗透性。此外，胆固醇可以结合许多跨膜蛋白，有助于维持或改变它们的构象。胆固醇还与许多甾醇转运蛋白相互作用，促进胆固醇运输并调节其亚细胞分布。胆固醇还通过酶促和非酶促途径产生各种氧甾醇，其中一部分可以被进一步代谢成胆汁酸，通过胆汁分泌排出。

从头合成胆固醇涉及20多步，主要分为四部分：甲羟戊酸的合成、异戊二烯的合成、角鲨烯的合成和角鲨烯转变为胆固醇。参与胆固醇合成的大部分酶位于内质网（ER）的膜中。其中，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）和角鲨烯单加氧酶（SM）作为限速酶，具体合成过程如图所示。除了从头生物合成外，血液中低密度脂蛋白（LDL）颗粒携带的胆固醇还可以被极化细胞（如肠细胞或肝细胞）基底表面的LDL受体（LDLR）吸收，同时游离胆固醇也可以被肠道中的肠细胞从膳食来源吸收，肝脏中的肝细胞可以从胆管中的胆汁中吸收。

参考文献：

[1] Luo J, Yang H, Song BL.Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(4):225-245.

有研究表明胆固醇合成和吸收之间的相互关系调节着循环胆固醇水平，以应对饮食或胆固醇干预。然而，负责协调胆固醇吸收和合成之间平衡的特定因素，以及这些因素如何精确地调节平衡，仍然知之甚少。但又因为血清胆固醇水平升高会增加动脉粥样硬化和心血管疾病的风险，所以弥补该区域的空缺非常重要。近期发表在Cell的一篇名为“A gut-derived hormone regulates cholesterol metabolism”的文章鉴定了一种在人类中由C7orf50和在小鼠中由3110082I17Rik编码的尚未被识别其功能的激素，研究人员将其命名为肠抑脂素（Cholesin，其具有抑制胆固醇合成的作用）。Cholesin是由于肠道对胆固醇的反应而分泌的对抗胆固醇的激素，它抑制肝脏中胆固醇的合成和VLDL的分泌，从而导致循环胆固醇水平的降低。此外，Cholesin的单核苷酸多态性(SNP)突变体rs1007765可促进Cholesin的表达，并与人类循环胆固醇水平呈负相关。本文表明，Cholesin通过结合其受体GPR146 (G蛋白偶联受体146，一种先前有研究表明的可以参与调节胆固醇代谢的G蛋白偶联受体(GPCR)中的孤儿受体（小编注：孤儿受体（orphan receptor）是指一些与其他已确认的受体结构上明显相似，但其内源配体还未发现的受体。GPCR是个庞大的蛋白家族，目前人们已知的有800多种，其中约100多种是“孤儿受体”），抑制蛋白激酶A(PKA)和细胞外信号调节激酶1和2 (ERK1/2)的信号传导，以及SREBP2控制的胆固醇合成。因此，胆固醇-GPR146轴是肠道吸收胆固醇和肝脏抑制胆固醇合成之间的分子联系。由于Cholesin具有降低循环胆固醇水平和缓解动脉粥样硬化的作用，Cholesin有望用于高胆固醇血症和动脉粥样硬化的治疗。

敲黑板啦！

1.Cholesin是一种由胆固醇诱导、经外泌体分泌的肠道激素；

2.Cholesin可以调节人和小鼠的血浆胆固醇水平，且敲除Cholesin引起血浆胆固醇积累；

3.Cholesin与其受体GPR146结合抑制胆固醇合成；

4.Cholesin与他汀类药物联用可预防高胆固醇血症和动脉粥样硬化。

研究结果

1.Cholesin是一种胆固醇诱导的肠道激素

为了研究肠道胆固醇吸收与肝脏胆固醇合成之间的潜在协调关系，研究人员将小鼠禁食过夜，然后饲喂含0.02%胆固醇的普通饮食(RD)或1.25%高胆固醇含量的西方饮食(WD)。在该实验中，含1.25%胆固醇的高胆固醇饮食可提高胆固醇的总吸收率，从而最大限度地发挥胆固醇吸收对胆固醇合成的抑制作用。与RD饲喂相比，WD饲喂增加了肠道内胆固醇水平，表明肠道内胆固醇吸收增加(辅图1A)。然而，肝脏和血浆中的胆固醇水平直到喂食4小时后才受到影响，这与之前的研究结果一致（小编注：之前有研究表明在外源高胆固醇摄取的调节下，小鼠自身的胆固醇合成减少，导致喂食4小时肝脏和血浆中的胆固醇才受到影响）(辅图1A)。在WD饲喂后肠道胆固醇含量升高的同时，肠道中胆固醇合成标志物Hmgcr的表达下调(辅图1B)，这表明了胆固醇作为其自身合成调节器的负反馈机制。并且无论是mRNA还是蛋白水平，RD和WD喂养后肝脏Hmgcr的表达均呈现出显著下降的趋势，随后又恢复，其中WD饲喂具有更强的抑制作用(辅图1B)。这些结果表明，除了胆固醇之外，还有其他因素参与调节肠道胆固醇吸收后的肝脏胆固醇合成。随着时间的推移，HMGCR表达的增加可能归因于进食诱导的SREBP2激活和HMGCR蛋白水平的转录后调控。

为了确定参与调节肠道胆固醇吸收和肝脏胆固醇合成的调节因子，研究人员对禁食16小时后饲喂RD或WD 1小时的小鼠血浆蛋白进行了分析。去除白蛋白、IgG并富集低丰度蛋白后，研究人员用银染（小编注：银染是一种检测聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法，其原理是在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的氨基酸基团有关，银染的详细机制还不是非常清楚，但由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1ng的蛋白质点，故广泛地用在2D凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中）显示了血浆蛋白(图1A)。结果表明WD饲喂后，在23kDa附近有一个增强的条带，且经质谱(MS)测序显示该蛋白为未鉴定的人源蛋白C7orf50的同源物(图1A，辅图1C，辅表1)。该蛋白在物种间表现出高度的保守性，在人和小鼠之间具有64.17%的同源性(辅图1D)，但其具体功能尚不清楚。基于这种蛋白质的后续表征，研究人员将其命名为“Cholesin”，指的是它在胆固醇合成中的抑制作用，并且HEK293T细胞中过表达人源性和小鼠源性Cholesin可导致该蛋白的分泌(辅图1E、F)。为了进一步研究Cholesin，研究人员在Hi-Five细胞（小编注：High Five (BTI-TN-5B1-4)细胞是来自于亲本粉纹夜蛾细胞系（粉纹夜蛾卵巢）的克隆分离株，通常用于使用杆状病毒表达载体系统 (BEVS) 进行的重组蛋白表达。并能够获得较高水平细胞生长和重组基因表达）中过表达C端His-tag标记的小鼠Cholesin，并通过质谱分析确定其氨基酸序列(辅图1G，辅表2)。以上结果均表明全长Cholesin是分泌型的。

在小鼠中发现Cholesin后，研究人员继续探究重新进食是否对血浆Cholesin水平有影响。结果显示，在重新进食的小鼠中，血浆Cholesin水平迅速升高，并在重新进食WD 1小时后达到约1200pM左右的峰值(图1B)。重新进食RD也引起了类似的血浆Cholesin水平，尽管与重新进食WD相比反应较弱(图1B)。重要的是，在人体中观察到类似的结果，在被喂食的个体中，血浆Cholesin水平显著提高(图1C，辅表3)综上所述，这些结果表明Cholesin是在进食反应中分泌的，胆固醇可能是Cholesin的一种诱导剂。

为了确定进食后哪些组织分泌Cholesin，研究人员在蛋白质水平上对Cholesin进行了组织分布分析。此外，研究人员还将缺乏Cholesin的小鼠作为对照进行比较。结果显示，Cholesin在小肠和结肠中高表达，在胃中低表达（图1D，辅图1H）。基于以上结果，研究人员构建了Cholesin肠道特异性敲除(IKO)小鼠(图1E)。随后，研究人员利用来自Cholesin全身敲除的小鼠血浆作为空白对照，使用酶联免疫吸附法(ELISA)测量血浆Cholesin水平。由于血浆Cholesin水平在饲喂后1 h达到峰值，因此研究人员选择禁食16 h（fasted）和重新进食1h后(refed)测量血浆Cholesin。在野生型(WT)小鼠中，重新进食WD后血浆Cholesin水平从约500 pM显著增加到约1200 pM。相比之下，在IKO小鼠中，WD诱导的Cholesin水平约为400pM(图1F，辅图1I)。为了进一步证实胆固醇在促进Cholesin分泌中的作用，研究人员给小鼠灌胃了胆固醇。结果显示，与WD喂养所观察到的效果相似，胆固醇灌胃处理显著增加了WT小鼠Cholesin分泌，从450pM增加到1500pM。然而，IKO小鼠的Cholesin水平依旧为400pM左右(图1G，辅图1J)。与Cholesin IKO对肠道胆固醇含量的潜在影响不同，WT和IKO小鼠的肠道胆固醇水平相当（小编注：说明cholesin敲除不影响肠道胆固醇吸收）(图1F、G)。总之，这些结果证明Cholesin是一种肠道来源的激素，对胆固醇的吸收做出反应。

2.NPC1L1介导的胆固醇摄取促进Cholesin分泌

胆固醇是通过在肠上皮细胞顶端表面的NPC1L1进行吸收的。研究人员假设胆固醇吸收诱导的Cholesin可能在肠上皮细胞中表达。为了验证这一观点，研究人员构建了Cholesin-GFP敲入小鼠，并将它们与Apoa1-mCherry敲入小鼠杂交（小编注：Apoa1是肠上皮细胞的一种标记蛋白。肠上皮是一个高度结构化的组织，由重复的隐窝绒毛单位组成，在不同的绒毛区域可能依次表达着不同的功能，一篇发表在Cell上的文章“Spatial Reconstruction of Single Enterocytes Uncovers Broad Zonation along the Intestinal Villus Axis”将小鼠肠绒毛底部至顶部之间五等分，通过激光捕获显微切割、RNA-seq和scRNA-seq得到了沿肠绒毛基因表达的综合空间图，隐窝之上的绒毛底部是应答菌群的“抗微生物区”，之后的肠上皮细胞顺序性表达氨基酸、碳水化合物、多肽、脂肪转运/吸收的相关基因（主要有Apobec1、Apob、Apoa4、Apoa1和Npc1l1）。因此，Apoa1虽然在肝脏中也高度表达，但是由于肠上皮细胞不同区域表达基因的富集情况不同，Apoa1也可以作为肠上皮细胞顶端区域的marker）。结果显示，Cholesin-GFP与APOA1-mCherry共定位（图2A），这表明Cholesin在肠细胞中表达。为了研究胆固醇是否直接影响Cholesin分泌，研究人员评估了在人结直肠癌细胞(HCT116细胞)中不同胆固醇水平对稳定表达Flag标签的Cholesin分泌的影响。随着胆固醇浓度的增加，研究人员观察到Cholesin水平在培养基中以剂量依赖的方式升高(图2B)。此外，HCT116细胞中NPC1L1的敲低(KD)破坏了胆固醇吸收和Cholesin分泌(图2C，辅图2A、B)。这些结果共同表明，NPC1L1介导的胆固醇摄取刺激Cholesin分泌。

为了证实小鼠Cholesin分泌需要依赖NPC1L1的胆固醇摄取，研究人员采用了两种方法:使用NPC1L1抑制剂衣折麦布（小编注：NPC1L1是一种跨膜蛋白，对于肠道胆固醇吸收是必需的，其主要通过囊泡内吞作用摄取膳食胆固醇。首先，胆固醇与NPC1L1的氨基末端结构域结合，诱导其羧基端与质膜分离，从而暴露出其内吞基体Y1306VNxxF（x代表任何氨基酸）以供NUMB蛋白识别。NUMB招募AP2/网格蛋白生成囊泡，启动胆固醇的内吞。与此同时，NPC1L1还会和Flotilin-1/-2相互作用形成富含胆固醇的膜微域，将胆固醇和其他甾醇转运通过肠上皮细胞刷状缘、运送到肠上皮细胞内，使NPC1L1能有效招募大量的胆固醇内吞进入肠道，这是另一种独立于AP2但与其协同作用的内吞途径，更加详细的机制目前并不清楚。依折麦布对于NPC1L1的抑制一方面通过结合NPC1L1的胞外区C环第61位氨基酸来抑制其构象变化，阻止Y1306VNxxF解离和NUMB的招募；另一方面通过破坏NPC1L1和Flotilin-1/-2形成胆固醇膜微域，从而减少食物中以及胆汁中胆固醇的小肠吸收，达到降低血脂的作用）和 NPC1L1的基因敲除。结果显示，衣折麦布治疗和NPC1L1敲除均能有效阻断肠道胆固醇吸收和Cholesin分泌(图2D、E，辅图2C-F)。以上体外和体内实验结果均说明阻断NPC1L1抑制胆固醇诱导的Cholesin分泌。

 为了研究胆固醇是如何刺激Cholesin分泌的，研究人员用各种阻断分泌途径的化学物质处理细胞（小编注：研究人员给HCT116细胞添加不同的分泌抑制剂从而检测细胞培养基中的Cholesin含量，其分泌抑制剂包括：（1）brefeldin A（5ug/ml）：可破坏高尔基体的结构并抑制其功能，进而特异地阻断蛋白质从内质网向高尔基体的转运；（2）glibenclamide（50uM）：直接结合并阻断KATP的SUR1亚基并抑制囊性纤维化跨膜传导调节蛋白CFTR，诱导膜离子通透性干扰线粒体功能；（3）GW4869（10uM）：中性鞘磷脂酶N-SMase的抑制剂，具有选择性和非竞争性，可抑制外泌体合成/释放；（4）manumycin A（10uM）：一种抗生素，通过靶向抑制Ras/Raf/ERK1/2信号转导从而抑制外泌体生物发生及分泌）。结果显示，一种可以抑制外泌体生成和释放的药物GW4869在胆固醇处理后可以显著减少Cholesin分泌(辅图2G)。此外，通过对释放的外泌体进行免疫印迹(IB)实验结果证明了Cholesin确实在外泌体中富集(辅图2H)。此外，用蛋白酶K处理释放的外泌体导致Cholesin和CD81(一种外泌体跨膜标记蛋白)的消失，而肿瘤易感基因101 (TSG101，一种外泌体腔内标记蛋白)得以保留(辅图2I、J)（小编注：蛋白酶K可以降解外泌体膜上蛋白和与其直接接触的蛋白，而不能酶解包含在完整外泌体内部的蛋白，说明Cholesin结合在外泌体膜上）。以上结果表明Cholesin是通过外泌体分泌的。

图2 NPC1L1介导的胆固醇摄取增强Cholesin分泌

辅图2 NPC1L1敲除的HCT116细胞和小鼠的相关数据

3.Cholesin调节人血浆胆固醇水平

Cholesin位于人类7号染色体(Chr7)的p22区域，该区域与各种人群中的高胆固醇血症密切相关。研究表明，位于Cholesin基因3’末端附近的两个特异性SNPs rs10236293和rs1007765与血浆胆固醇水平有显著的相关性(图3A，辅表4)。为了确定Cholesin和血浆胆固醇水平之间的相关性，研究人员对六百人的血浆Cholesin和胆固醇水平进行了测量。结果显示，血浆Cholesin水平与总胆固醇(TC)水平(p < 0.0001)、LDL-C水平(p < 0.0001)呈负相关，而与高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平无显著相关性(p = 0.1875)(图3B、C，辅图3A-E，辅表5)。此外，血浆Cholesin水平与TG水平呈负相关(p = 0.0438)(图3D)。Cholesin与APOB呈显著关联(图3E，辅图3A、F，辅表5)。以上数据为表明Cholesin和血浆胆固醇水平之间的关系提供了证据。

 接下来，研究人员研究了两个已鉴定的SNPs(rs10236293和rs1007765)是否影响血浆Cholesin和胆固醇水平。结果显示，在多个细胞系中发现这两个SNP都定位于顺式调控元件(CREs)。两种CREs均对DNase I表现出超敏反应和对表观遗传修饰如H3K4me3和H3K27ac的富集（小编注：此处是利用了3DSNP数据库进行分析，3DSNP是一个集成数据库，通过探索人类非编码区突变在基因和调控元件之间的远端相互作用来注释突变，包括染色质状态、组蛋白修饰、DNaseI超敏感位点以及转录因子结合位点，从而可推断SNPs在promoter、enhancer或conservation的得分。首先，两个SNPs预测均定位于CREs，CRE2表现出DNase I的超敏反应以及两者对于H3K4me3和H3K27ac的富集，说明染色质构象开放激活了基因表达，而3DSNP中分析得到的位置权重矩阵图表明两个SNP位于增强子内），这表明开放的染色质构象激活了基因表达(图3F，辅表4)。研究人员对基因表达数据的进一步挖掘表明，这两个SNP都位于增强子区域(图3F)。对人体数据分析显示，携带任一SNP的个体表现出血浆Cholesin水平升高，血浆TC和LDL-C水平降低(图3G-I，辅图3A、G，辅表5)。

此外，与Cholesin表达和胆固醇水平相关的两个SNP非常接近(<200 bp，图3F)，并且处于完全的连锁不平衡状态(在英国和中国南方汉族人群中，r2=1)。两者之间的这种紧密联系意味着它们不能在基因上分离，其中任何一种都可能解释对Cholesin和胆固醇水平的影响。为了确定哪些SNP影响胆固醇水平，研究人员在HEK293T细胞中敲除了CRE1中的rs10236293或CRE2中的rs1007765的侧翼序列。结果显示，CRE2而非CRE1的缺失显著降低了Cholesin的表达(图3J，辅图3H)。这表明rs1007765可能影响Cholesin的表达。重要的是，CRE2缺失特异性地降低了Cholesin的表达，而不影响其他邻近基因(图3J)。为了直接评估哪个SNP调控Cholesin的表达，研究人员将CRE片段置于mini巨细胞病毒(mini-CMV)启动子前，以检测其对下游Cholesin的转录调控作用(图3K)。结果显示，携带rs1007765的CRE2片段增加了Cholesin的表达。此外，rs1007765的C等位基因比G等位基因表现出更强的Cholesin表达增强(图3K)。敲入rs1007765的C等位基因后进一步证实了这一结论(图3L)。此外，在HCT116细胞中也获得了类似的结果(辅图3I、J)，这表明rs1007765在不同组织来源的细胞中上调Cholesin表达的保守作用。总之，这些结果表明rs1007765增加Cholesin的表达，说明Cholesin可能降低人类血浆胆固醇水平。

图3 Cholesin调节人体血浆胆固醇水平

辅图3 rs10236293和rs1007765 SNPs的相关数据

4.Cholesin敲除增加肝脏胆固醇合成和VLDL分泌

根据Cholesin与胆固醇之间的关系，研究人员进一步探究了Cholesin在胆固醇代谢中的作用。Cholesin IKO小鼠在喂食RD或WD的雄性和雌性小鼠中均表现出血浆胆固醇水平显著增加(~20%)(图4A)，同时血浆TG水平也略有升高(图4A)，这与人类血浆Cholesin升高与较低胆固醇水平相关的遗传研究结果一致，相应地，Cholesin IKO小鼠肝脏胆固醇含量增加，而体重、脂肪量、食物和水摄入量、呼吸交换比(RER)、运动和血糖水平未受影响(图4B，辅图4A-F)。随后研究人员通过快速蛋白液相色谱(FPLC)（小编注：快速蛋白液相色谱（Fast protein liquid chromatography）是专门用来分离蛋白质、多肽及多核苷酸的系统，是由经典的液体柱层析引入气相色谱理论，并且对相体进行了改革，它不但保持了HPLC的快速、高分辨率等特性，而且还具有柱容量大、回收效率高及不易使生物大分子失活等特性。因此在近年来在分离蛋白质、多肽及寡核苷酸等方面得到了广泛应用）分析血浆脂蛋白显示，Cholesin IKO小鼠的HDL-C、LDL-C和VLDL-C均升高(图4C)。总的来说，这些结果表明Cholesin缺乏会导致血浆胆固醇水平升高。

  Cholesin IKO小鼠血浆胆固醇水平升高可能源于多种因素，包括肠道胆固醇吸收增强、肝脏胆固醇合成、VLDL分泌增加、组织摄取清除率降低以及胆汁和胆固醇的胆道排泄改变。然而，WT与KO小鼠之间脂肪量、食物摄入量和肠道TC/TG含量相似，这表明小鼠之间存在相似的肠道吸收(辅图4A-G)。因此，研究人员通过给小鼠口服一定剂量的橄榄油而开展了脂质耐受性试验，评估了乳糜微粒分解代谢率，结果显示在Cholesin IKO小鼠中没有受到影响(辅图4H)。在Cholesin IKO小鼠中，胆囊胆固醇、BA水平或粪便TC/TG含量无显著差异(辅图4I、J)。此外，参与HDL生物合成的Apoa1和Abca1以及参与胆囊胆固醇分泌相关的Abcg5和Abcg8的肝脏mRNA水平在Cholesin IKO小鼠中没有受到影响(辅图4K)。总之，以上结果表明，肝脏胆固醇合成和VLDL分泌的增加可能导致Cholesin IKO小鼠血浆胆固醇水平升高。

接下来，研究人员检测了胆固醇合成基因mRNA与蛋白水平的表达。Cholesin IKO导致饲喂RD和WD的小鼠肝脏中SREBP2活性和胆固醇生成基因表达增加(图4D、E)。值得注意的是，胆固醇生成基因的表达水平在WD喂养的小鼠中较低，这表明肠道胆固醇吸收抑制肝脏胆固醇合成。此外，Cholesin IKO小鼠中参与脂肪酸合成的基因表达水平增强(图4D、E)（小编注：VLDL主要由TG、胆固醇、磷脂和载脂蛋白构成，其中TG一部分来源于脂肪酸合成，因此参与脂肪酸合成的基因表达上升可能是由于VLDL的分泌增加）。为了评估Cholesin是否影响VLDL分泌，研究人员给小鼠注射了poloxmer-407(一种脂蛋白脂肪酶抑制剂)，从而抑制外周VLDL和TG水解，并监测血浆TC和TG水平。结果显示RD和WD喂养的雄性和雌性小鼠的TC和TG分泌均显著提高(图4F)。同时，在Cholesin IKO小鼠中，VLDL颗粒上的结构蛋白APOB的分泌显著增加(图4F)。研究人员推测，可能是由于TC/TG合成速率的增加导致了VLDL分泌的增加，因为参与肝脏VLDL组装和分泌的基因，如Mttp、ApoB、Dgat1、Dgat2和Sort1的mRNA水平在Cholesin WT和IKO小鼠中是相似的(辅图4K)。总之，这些结果表明Cholesin的缺失至少在一定程度上通过增加肝脏胆固醇合成和VLDL分泌而升高血浆胆固醇水平。

图4 Cholesin缺乏提高肝脏胆固醇合成和VLDL分泌

辅图4 Cholesin敲除对代谢的影响

5.GPR146是Cholesin的受体

为了确定Cholesin的靶组织，研究人员将纯化的GST-Cholesin与不同小鼠组织的冷冻切片孵育从而进行了结合实验。结果显示，在肝脏、脂肪组织、肾脏和骨骼肌中观察到了更强的结合信号(图5A)。在鉴定Cholesin受体时，研究人员使用流式细胞术来评估不同细胞系结合Cholesin的能力。在测试的细胞系中，MCF7(人乳腺腺癌细胞系)与Cholesin结合最强(辅图5A、B)。接下来，研究人员使用慢病毒文库在稳定表达Cas9的MCF7细胞中进行了全基因组筛选，该文库包含65383个靶向19050个编码人类基因蛋白质的signal-guide RNA(sgRNAs)，21864个靶向microRNAs (miRNAs)的sgRNAs，以及3000个非靶向对照的sgRNAs (图5B)。研究人员从Cholesin结合缺失的细胞中收集了基因组DNA，对sgRNAs进行测序和分析(图5B，辅表6)。分析结果首先确定的候选者是GPR146(图5C、辅图5C，辅表6)，它是一个参与胆固醇合成调节保守较强的GPCR中的一个孤儿受体。

为了确认GPR146是否是Cholesin的受体，研究人员检测了Gpr146^−/−小鼠组织中Cholesin的结合情况。结果显示，Gpr146^−/−小鼠的组织和原代肝细胞中Cholesin结合情况完全消失(图5A、D、E)。此外，通过额外的GST pull down实验和微尺度热泳(MST)（小编注：微量热涌动（MicroScale Thermophoresis，MST）技术是一种基于检测在温度梯度中的生物分子电泳迁移率的变化而检测生物分子间结合、解离过程，获取分子间相互作用的模式和动力学常数等方面信息的新技术。已知荧光标记的目标分子最初是自由均匀分布的，在红外激光照射下，分子受到热泳动的作用力，从加热区域向低温区域移动，同时分子又受到浓度梯度和质量扩散力的作用，最后分子在热泳动作用力和质量扩散作用力下达到平衡，形成稳定态）证实，Cholesin与GPR146具有高亲和力(Kd = 21.34±0.98 nM)(图5F、G，辅图5D-F)。基于GPR146的保守性和预测的结构，研究人员用丙氨酸取代了6个氨基酸，构建了GPR146的突变体(Mut)(辅图5C、D)。与WT GPR146相比，Mut GPR146对Cholesin的亲和力明显降低，并且不能恢复Gpr146^−/−原代肝细胞中Cholesin的结合(图5D-G，辅图5C-G)。

总之，以上的体外和体内结合试验证实GPR146是Cholesin的受体。在确定了Cholesin与GPR146的相互作用后，研究人员探究了GPR146在小鼠原代肝细胞中的下游信号传导。Cholesin处理破坏了GPR146与鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α1 (GNAI1)的相互作用，这种作用被GPR146的Cholesin结合缺陷突变体减弱(图5H)。与上述结果一致，Cholesin处理降低了WT原代肝细胞的细胞内cAMP水平，但在Gpr146^−/−原代肝细胞中没有此现象(图5I)。感染了WT GPR146的过表达病毒则恢复了Cholesin对Gpr146^−/−肝细胞cAMP水平的抑制作用(图5I)。综上所述，这些结果表明Cholesin通过GPR146偶联Gαi信号通路抑制cAMP的产生。

图5 GPR146是Cholesin的受体

辅图5 Cholesin受体GPR146的鉴定

6.Cholesin以GPR146依赖的方式抑制胆固醇合成

Cholesin呈剂量依赖性地抑制肝脏Hmgcr的表达，并且腹腔注射5 mg kg⁻¹Cholesin的效果最大(辅图6A、B)。接下来，研究人员评估了单次和多次腹腔注射Cholesin(5 mg kg⁻¹)对肝脏Hmgcr表达、血浆胆固醇水平和肝脏胆固醇水平的影响(辅图6C-F)。与单次注射Cholesin相比，多次注射Cholesin对肝脏Hmgcr表达的抑制作用更为明显(辅图6D)。此外，多次注射Cholesin后，血浆和肝脏胆固醇水平显著降低(辅图6E、F)。因此，研究人员进一步通过多次注射来检查Cholesin对小鼠胆固醇合成的影响。

GPR146作为Cholesin受体，但Cholesin是否通过GPR146抑制小鼠胆固醇合成尚不能定论。因此研究人员通过多次注射Cholesin到小鼠体内进行实验，结果表明Cholesin注射降低了WT (Gpr146^fl/fl)小鼠的胆固醇生成基因表达、肝脏胆固醇含量和血浆TC水平(~ 15%)(图6A-D，辅6G)。此外，Cholesin降低了TG水平，但对体重和食物摄入量没有影响(辅图6H-K)。先前有研究表明血浆胆固醇水平主要受肝源性GPR146的影响，因此，研究人员测试了腺病毒介导的WT和Mut GPR146表达对肝脏特异性Gpr146 KO (LKO)小鼠胆固醇合成的影响。与先前的结果一致，Gpr146 LKO小鼠表现出胆固醇合成、血浆TC水平(~ 15%)和血浆TG水平的降低(图6A-D，辅图6H-L)。重要的是，Cholesin对Gpr146 LKO小鼠胆固醇合成和血浆TC水平的抑制作用被减弱(图6A-D)。然而，感染WT GPR146表达病毒则恢复了Cholesin对TC和TG水平的抑制作用(图6A-D，辅图6H-L)。综上所述，GPR146对于Cholesin降低胆固醇合成至关重要。

GPR146已被证明通过激活ERK1/2通路刺激胆固醇合成。然而，Cholesin对cAMP/PKA的调节是否会影响ERK的激活，并阻碍随后的胆固醇合成仍不确定。根据已发表的研究结果，在Gpr146 LKO小鼠中观察到ERK1/2 (pERK1/2)活性降低(图6B)。Cholesin治疗在WT小鼠中降低了cAMP/PKA信号，但在Gpr146 LKO小鼠中没有这种作用(图6B)，这与其对原代肝细胞cAMP/PKA信号的抑制作用一致(图5I)。同样，Cholesin以GPR146依赖的方式抑制小鼠的pERK1/2水平。这些结论通过感染WT GPR146过表达病毒恢复Cholesin对cAMP/PKA和ERK1/2信号的抑制作用得到了进一步的验证(图6B)。为了确定ERK1/2信号通路对Cholesin活性的必要性，研究人员每天给WT和Cholesin IKO小鼠腹腔注射MEK(丝裂原活化蛋白激酶)抑制剂PD0325901 (PD，5 mg kg⁻¹)，连续14天。与现有的研究结果一致，通过PD治疗引起的WT小鼠ERK抑制，进一步导致血浆TC/TG水平和胆固醇生成基因表达显著降低(辅图6M-P)，并且PD治疗显著降低了Cholesin IKO小鼠胆固醇合成基因的上调表达和血浆TC水平的增加(辅图6M-P)。Gpr146基因位于人类和小鼠基因组中的Cholesin基因内，并且转录方向相反(图3A)。因此，研究人员探究了一个基因的缺失是否会影响另一个基因的表达。Gpr146的KO对Cholesin mRNA表达无影响，反之亦然（小编注：当两个基因的方向相反时，它们被称为反向基因或头对头基因。这种情况下，一个基因的敲除可能不会影响另一个基因的表达，原因可能包括：1.启动子和调控序列独立性：每个基因都有自己的启动子和调控序列，这些序列负责启动和调节基因的转录。如果长基因和短基因拥有独立的调控序列，并且这些序列在长基因的敲除过程中未受影响，短基因的表达就不会受到影响。2.转录机制：反向基因可能使用不同的转录机制。例如，它们可能由不同的转录因子和RNA聚合酶复合体负责转录，或者在转录过程中有不同的时空特异性。因此，即使长基因被敲除，短基因的转录也可能继续正常进行。3.RNA加工和稳定性：mRNA水平不仅受转录调控的影响，还受到RNA加工、运输、稳定性和降解等后转录调控的影响。如果这些后转录过程对短基因没有影响，短基因的mRNA水平也可能保持不变。4.表观遗传调控：基因表达还受到表观遗传调控的影响，包括DNA甲基化、组蛋白修饰等。如果长基因的敲除没有改变短基因所在区域的表观遗传状态，短基因的表达可能不会受到影响。5.基因敲除的特异性：如果使用的基因敲除技术（如CRISPR/Cas9）具有很高的特异性，并且设计时确保只针对长基因的特定序列，那么短基因的DNA序列和表达调控区域可能未受损害，从而保持其正常的mRNA水平。6.功能冗余和补偿机制：在某些情况下，即使两个基因方向相反，它们也可能在功能上有一定的冗余性。长基因的敲除可能通过其他途径或基因进行补偿，从而不影响短基因的表达。综上所述，反向基因之间的表达调控是复杂的，受到多种因素的影响。在特定情况下，长基因的敲除可能不会对短基因的mRNA水平产生影响。要准确理解这种现象，需要对基因的表达调控机制进行深入研究）（辅图6Q、R)。以上结果表明Cholesin抑制cAMP/PKA信号传导，至少在一定程度上通过ERK1/2信号级联降低胆固醇合成。

图6 Cholesin通过GPR146抑制胆固醇合成

辅图6 Cholesin抑制胆固醇合成

7.Cholesin可以预防高胆固醇血症和动脉粥样硬化

 他汀类药物是治疗高胆固醇血症的常用处方药。它们通过抑制HMGCR活性、增加LDLR介导的胆固醇摄取来减少胆固醇合成。然而，他汀类药物由于能够显著增加Hmgcr和其他胆固醇生成基因的表达而受到众多科学家的质疑（小编注：SREBP与HMGCR启动子近端区域的甾醇调节元件（SRE）结合触发HMGCR的转录以加速胆固醇的生物合成。SREBP还能够与低密度脂蛋白受体（LDLR）启动子中的SRE结合，LDLR是负责肝脏中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）清除的分子。SREBP作为一种转录因子需要由SREBP切割激活蛋白（SCAP）从内质网伴随到高尔基体，其中SREBP被鞘氨醇-1-磷酸（S1P）和S2P蛋白酶切割成成熟和功能形式。然而细胞内胆固醇可以与内质网上未成熟的SREBP相互作用。因此，当使用他汀类药物时，细胞胆固醇水平降低，反而使得成熟的SREBP增加，从而激活HMGCR表达。相反，当细胞胆固醇水平升高则会抑制HMGCR的表达）。考虑到Cholesin对降低胆固醇生成基因表达的作用，研究人员探究了Cholesin单独使用或与瑞舒伐他汀(Ros)联合使用是否可以在Ldlr^-/-小鼠（该小鼠的脂质谱与血脂异常人群非常相似）中改善动脉粥样硬化(图7A)。结果表明，未经治疗的Ldlr^-/-小鼠血浆Cholesin水平略有升高(辅图7A、B)，这表明Cholesin水平的略微升高并不足以完全抑制血浆胆固醇的升高。然而Cholesin治疗显著降低了胆固醇生成基因表达和血浆TC水平(图7B-E)。重要的是，Cholesin注射也导致动脉粥样硬化病变显著减少(图7F)。同样，Ros处理降低了胆固醇合成、血浆TC水平和动脉粥样硬化病变，但导致胆固醇生成基因表达上调(图7B-F)。Cholesin和Ros联合治疗减轻了单独使用Ros诱导的胆固醇合成代偿性增加，从而对血浆TC水平和动脉粥样硬化病变产生更明显的抑制作用(图7B-F)。此外，通过血浆丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平评估，Cholesin和Ros联合治疗导致在没有减少食物摄入量的情况下的体重增加减少，TG水平降低，肝脏脂质积累减少，炎症减轻(辅图7C-I)。综上所述，这些结果表明，Cholesin单独或Cholesin与他汀类药物联用对高胆固醇血症和动脉粥样硬化具有显著的保护作用。

图7 Cholesin可以预防高胆固醇血症和动脉粥样硬化

辅图7 Cholesin减少肝脏脂质累积

总结

机体内的胆固醇调节对于维持机体代谢的相对稳定至关重要，胆固醇稳态的调节会涉及到多种器官组织的代谢通路的变化。人体血液中胆固醇含量的升高会导致动脉粥样硬化风险的升高，并同时关系到多种心脑血管疾病。因此如何通过寻找治疗动脉粥样硬化的靶点，进而有效治疗高胆固醇血症、动脉粥样硬化降低心脑血管疾病的风险至关重要。

肠道胆固醇吸收和肝脏重新合成胆固醇之间的相互协调对维持胆固醇稳态至关重要，然而控制这些过程的相反调节机制仍然知之甚少。在本篇文章中，研究人员鉴定了一种激素—Cholesin，它能够抑制肝脏中的胆固醇合成，导致循环胆固醇水平降低。Cholesin是由一种功能未知的基因编码的(在人类中是C7orf50，小鼠中是3110082I17Rik)，它由肠道分泌以应对胆固醇吸收，并与GPCR中的孤儿基因—GPR146结合。通过抑制PKA信号传导，从而抑制肝脏中SREBP2控制的胆固醇合成，发挥下游拮抗的作用。该研究结果表明，Cholesin- GPR146轴介导肠道胆固醇吸收对肝脏胆固醇合成的抑制作用。因此，新发现的激素Cholesin也有望成为对抗高胆固醇血症和动脉粥样硬化的有效药物。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867424002265?via%3Dihub

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