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《狂犬病疫苗》讲稿 9: 疫苗生产流程的质量控制和检定

已有 10244 次阅读 2013-7-4 12:01 |个人分类:狂犬病防治|系统分类:科普集锦|关键词:狂犬病,疫苗,讲稿,,不良反应| 狂犬病, 疫苗, 讲稿, 不良反应

44.9 疫苗生产流程的质量控制和检定

除了细胞培养人用疫苗制备工艺和质量控制的通用要求(如无菌检查、外源因子检查、外观 、装量、pH值、异常毒性检查、细菌内毒素含量、蛋白质含量检查、热稳定性试验、抗生素残留量检查、牛血清白蛋白残留量、稳定剂添加、游离甲醛含量、硫柳汞含量、冻干成品含水量检测等)之外,对人用狂犬病疫苗生产过程中重要的质量控制要求和检定方法说明如下(国家药典委员会,2010)

44.9.1 病毒纯化

灭活后的病毒液采用柱层析(根据病毒与杂质颗粒大小来分离)、蔗糖密度梯度离心(根据病毒密度来分离)等适宜的方法纯化,纯化后可加入适量人血白蛋白或其他适宜的稳定剂即为原液。对于采用柱色谱法进行纯化的,应规定色谱柱的介质、每次上样量、流速、洗脱液、检测波长、收集峰以及在何吸收值范围内收集。使用柱色谱纯化,柱高、流速、上样量应经过验证;对于采用蔗糖密度区带离心法进行纯化的,应规定蔗糖介质的浓度范围,每次上样量、离心力、检测波长、收集范围等参数,采用此法纯化后一般采用超滤法去除蔗糖。当原液完全符合下述要求时,可用于半成品疫苗的制备。

44.9.2 病毒灭活

常用病毒灭活剂包括β-丙内酯(β-PL)和甲醛。β-PL通过降解核酸来灭活病毒,而不直接作用于蛋白。β-PL为含有四元环的烷化剂, 分子式为C3H4O2, 能与包括核酸在内的许多亲和物质反应, 主要通过核酸或蛋白酶的羟基、以及氨基酸等集团进行烷化反应, 即这些集团的H原子被烷基取代的反应,β-PL对核酸的反应主要与嘌呤和嘧啶残基结构的修饰,特别是针对鸟嘌呤的1和7位氮原子以及腺嘌呤的3位氮原子的修饰,如此被β-PL修饰的鸟嘌呤被聚合酶错读成腺嘌呤,将导致DNA链复制时由原来的G-C配对而误译成A-T, 从而阻止新的活病毒复制[16]。 在高浓度β-PL作用下,烷基化嘌呤诱导DNA 脱嘌呤,从而导致糖苷键断裂,破坏DNA 链的完整性。它还可以诱导DNA 链打开缺口,使DNA和蛋白质之间以及双螺旋结构DNA链之间发生交联而发挥病毒灭活作用[16]。甲醛灭活原理是甲醛使微生物的蛋白质、核酸变性,导致死亡,但不明显影响其免疫原性。用甲醛灭活时间长,一般需要在37~39℃处理24h以上或更长时间,温度与灭活时间成反比。并且灭活的效果易受温度、pH、甲醛浓度等因素影响,残留的游离甲醛,若随疫苗注入机体后,会产生制激性反应。《中国药典》三部2010版规定病毒收获液中按1:4000的比例加入β—丙内酯或者终浓度200μg/ml加入甲醛灭活。该方法应证明具有灭活病毒的能力,但不破坏其免疫原性。《欧洲药典》7.0规定若使用β-丙内酯灭活病毒,浓度在任何情况下不得超过1:3500 。WHO规定β-丙内酯浓度在1:3500和1:5000之间,2~8℃至少灭活24小时 。

44.9.3  病毒灭活验证试验

灭活工艺结束时应立即取样进行病毒灭活验证试验。《中国药典》三部规定试验采用生产用毒株敏感的细胞中连续传代扩增三代,将样品混合后小鼠脑内接种,无动物死亡判定灭活试验符合规定。如不能立即进行试验,试验用样品应保存在-60°C以下冻存, 并应验证该条件不影响样品中可能残留病毒活力。

WHO和《欧洲药典》7.0:接种相当于不少于25个人用剂量的灭活病毒悬液至与疫苗生产相同类型的细胞培养物。每7天传代一次。总共培养21天后,再用免疫荧光试验检测细胞培养物中的狂犬病毒。若未检测到狂犬病毒,则病毒灭活符合要求。与动物试验相比,细胞培养法缩短了检测时间且不存在免疫系统的干扰,根据细胞内荧光灶的有无即可直接证明样品中是否存在活病毒,避免了小鼠间个体差异的影响,使检测结果具有更好的灵敏度和重复性

44.9.4 病毒鉴别试验和糖蛋白(抗原)含量检定

采用酶联免疫吸附或抗体结合试验,酶标板包被抗狂犬病毒的糖蛋白或/和抗狂犬病毒核蛋白的抗体,检测疫苗中的相应狂犬病毒抗原,糖蛋白含量应对特定产品的允许限度内。《欧洲药典》7.0放在半成品检测抗原含量。采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)。将标准品、待测样本加入到预先包被抗狂犬病毒多克隆抗体透明酶标包被板中,温育足够时间后,洗涤除去未结合的成分,再加入酶标工作液,温育足够时间后,洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B,底物(TMB)在辣根过氧化物酶(HRP)催化下转化为蓝色产物,在酸的作用下变成黄色,颜色的深浅与样品中牛的牛血清白蛋白残留检测浓度呈正相关,450nm波长下测定OD值,根据标准品和样品的OD值,计算样本中狂犬病毒抗原含量。该方法特异性高、敏感性高、稳定性强。

44.9.5 疫苗效价测定

疫苗效价应不低于2.5IU/剂(效期内),企业标准高于国家标准应按企业标准执行。检测疫苗效价的方法有小鼠效力中和试验(NIH)、免疫单扩散(SRD)、酶免疫分析(EIA)。2010版药典规定狂犬病疫苗效价应不低于2.5IU/剂,测定方法为NIH法,测定过程见附录Ⅺ A。因NIH法要用到CVS攻击毒,攻击毒滴度5~50LD50,小鼠本身的差异,对同一批疫苗检测的效价的95%置信区间是25%~400%(不同批实验动物、不同检测时间、不同操作者、不同实验室检测均会造成检测结果差异)。为尽可能使NIH方法准确,需要注意以下事项:小鼠在满足实验动物质量要求的前提下,小鼠是4周龄,体重11~15g;每制备1批CVS攻击毒最好用不少于200只小鼠制备脑悬液,其中40-50支小鼠测定LD50,混合悬液的滴度最好超过10LD50,攻击毒保存在-60℃,每批攻击毒要能保证能进行100次以上检测,通常可用2-3年[17]。SRD和EIA完全是一种化学反应,因此彼此之间有很好的相关性。尽管成品效价尚未采用这两种方法检测,但它们已运用在疫苗中间品的质量控制。




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