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《狂犬病疫苗》讲稿7:疫苗生产用细胞

已有 11527 次阅读 2013-6-29 08:53 |个人分类:狂犬病防治|系统分类:科普集锦|关键词:狂犬病 疫苗 讲稿 免疫 持久性 加强剂量| 免疫, 讲稿, 持久性, 狂犬, ∫呙

44.7  疫苗生产用细胞

解决狂犬病疫苗安全性的问题依赖于使用不含神经组织的细胞增殖狂犬病毒来制备疫苗。Kissling于1958年首先尝试使用原代地鼠肾细胞培养狂犬病毒(Kissling,1958)。1950年代—1960年代,开发了鸡胚和鸭胚来源的狂犬病毒组织疫苗。1960年代—1980年代,还开发了基于原代牛和狗肾细胞、纯化鸭胚细胞和纯化鸡胚细胞的狂犬病疫苗。1961年,Hayfick等人发现人二倍体细胞株WI-38(Hayfick et al.,1961)。1974年,人二倍体细胞狂犬病疫苗(WI-38、MRC-5)获得批准,WHO推荐作为狂犬病疫苗的金标准(Hayfick,1984)。1962年:Yasumura和Kawikata开发Vero细胞系。1985年,使用Vero细胞生产的狂犬病疫苗PVRV获得批准(Fournier, 1985)。  

44.7.1 当代狂犬病疫苗生产用的主要细胞

① 原代地鼠肾细胞(primaryhamster kidney cell culture,PHKC)

原代地鼠肾细胞疫苗(PHKCV)是第一种被批准的细胞培养狂犬病疫苗(CCRV)。狂犬病毒街毒株和固定毒株,譬如标准攻击毒CVS,于1958年在PHKC培养。1968年,加拿大批准使用狂犬病毒固定毒株CL-60(来源于阿拉巴马州达弗林街[SAD]分离株)的PHKCV。 自1971年起,前苏联使用Vnukovo-32毒株(SAD毒株在PHKC适应后的衍生株) 生产PHKCV( Sureau,1987)。1980年,中国武汉生物制品研究所林放涛教授领导的小组率先研制成功含铝佐剂的PHKCV,毒株为北京aG株,使用甲醛灭活。早期产品中最终的成品含有0.01%硫柳汞、10mg人白蛋白和氢氧化铝佐剂。中国于1980年批准PHKCV的使用,之后完全取代了Semple型狂犬病疫苗,使我国狂犬病疫苗的生产及时赶上了国际先进水平(Lin,1983)。在随后的二十多年里,我国生产的PHKCV曾是当时世界上累计生产量最大的狂犬病疫苗,高峰年份每年产销量超过500万人份。本世纪以来的产品去除了佐剂,并进一步纯化、浓缩。疫苗提供的形式为冻干浓缩制剂,并以5剂免疫方案进行应用。据报道,PHKCV耐受性良好,可以对证实的狂犬病毒暴露产生保护作用(Lin, 1990)。

此外,1974年研发出使用巴斯德毒株(PV株)的胎牛肾细胞狂犬病毒疫苗( Sureau, 1987),1978年研发出使用PM株的狗肾细胞的狂犬病毒疫苗。荷兰批准了上述两株疫苗。

地鼠肾细胞的制备:选用10~14日龄来自清洁级或清洁级以上地鼠,无菌取肾,剪碎,经胰蛋白酶消化,分散细胞,接种培养瓶,用适宜的培养液进行培养。来源于同一批地鼠、同一容器消化制备的地鼠肾细胞为一个细胞消化批。源自同一批地鼠、于同一天制备的多个细胞消化批为一个细胞批。

生产用地鼠应该来自封闭群,《中国药典》三部要求制备毒种的地鼠应来自SPF级,单次病毒收获液制备可以用清洁级地鼠。清洁级地鼠需要排除沙门菌、多杀巴斯德杆菌、支气管鲍特杆菌、泰泽病原体、仙台病毒、淋巴细胞脉络丛脑炎病毒、体外寄生虫、弓形虫全部蠕虫的感染。WHO要求用于生产的地鼠应是SPF级。SPF级地鼠的详细要求见《流行性乙型脑炎减毒活疫苗》标准注释和2010版《中国药典》附录ⅩⅢ B。

②  人二倍体细胞(humandiploid cell,HDC)

第一株人二倍体细胞株WI-38建立于1961年。美国费城Wistar研究所的工作人员用狂犬病毒CVS-24在WI-38细胞内增殖,以避免使用原代组织培养产生的问题,如对动物蛋白过敏( Hayflick, 1961)。约2年后,狂犬病毒PV株、PM株、HEP株和LEP株在HDC中能成功持续感染(Wiktor et al., 1964)。1974年12月法国批准狂犬病毒人二倍体细胞疫苗(HDCV),随后,美国在1980年6月也批准了该疫苗(Bernard et al.,1982)。HDCV是第一种纯化、浓缩和冻干的无任何佐剂的狂犬病疫苗,含有人血白蛋白作为稳定剂。HDCV被WHO推荐为金标准参考疫苗。与DEV、乳鼠大脑或成年动物大脑组织疫苗比较,HDCV可以在实验动物和人类中诱发更强烈的免疫应答,较少引起不良反应。迄今为止,仅有极个别的短暂的神经性麻痹疾病案例,可能与接种HDCV有某种相关性。这些技术进步促进了多种疫苗的研制,包括将病毒的Pitman-Moore株适应WI-38细胞,使用β-丙内酯灭活无细胞病毒,以及使用超滤法浓缩病毒。

目前,HDCV使用MRC-5人胚成纤维细胞进行生产,用Pitman-Moor L503 3M株接种。收获含有病毒的上清液,使用超滤法或超速离心法浓缩10-20倍,在病毒灭活前达到大约107半数致死剂量的滴度,病毒灭活则使用β-丙内酯。使用美国国立卫生研究院(National lnstitute ofHealth,NIH)提供的检测方法在小鼠中检测疫苗效价,每剂至少为2.5 IU。

在志愿者中进行了为期4年的临床研究后,人们使用疫苗在伊朗免疫被狂犬病犬和狼严重咬伤的人。所有被免疫人群均产生RVNA并存活,而且至今没有发生狂犬病。1976年,HDCV首先在欧洲获得批准用于暴露前和暴露后免疫。1980年6月,HDCV在美国获得批准。Winkler总结了在美国进行的为期5年的临床研究结果,疫苗预防狂犬病均获成功。据估计,85%的疫苗用于暴露前免疫和维持抗体的加强免疫,15%用于暴露后免疫。据估计世界范围内,超过150万人进行了HDCV免疫接种。

HDCV主要是狂犬病毒感染的MRC-5人胚成纤维细胞培养物的浓缩上清液。美国销售的每一剂疫苗中含有β-丙内酯灭活的狂犬病毒、5%人白蛋白、酚磺酞和作为抗生素的硫酸新霉素(neomycin sulfate, <150 μg)。疫苗经真空冻干处理制成粉末,然后使用无菌注射水复溶。疫苗不含防腐剂或稳定剂。

二倍体细胞株,包括WI-38MRC-5 FRhL-2,分裂能力有限(有限寿命是连续传代约50次),之后细胞衰老,这种现象称为Hayflick极限”。此外,二倍体细胞株很难大规模工业化培养用于疫苗生产。所以,HDCV成本仍然很高,典型地仅适用于发达国家。

③ Vero细胞(传代细胞)

全世界一直致力于生产成本更低,安全性和效力与HDCV相当或者有所提高的疫苗。根据NIH检测标准,所有CCRV的效价必须至少达到每剂2.5 IU。

Vero细胞系来源于非洲绿猴肾细胞,于1962年建立。Vero细胞支持狂犬病毒属多种基因型病毒的感染。在1978年,美国监管当局接受连续传代细胞系用于人用生物制品的生产(Petricciani et al., 2008。在20世纪70年代晚期和80年代早期,曾以Vero细胞为基质生产商业用灭活脊髓灰质炎疫苗(Pullen et al., 1985)。在20世纪80年代早期,以Vero细胞为基质生产狂犬病疫苗(Roumiantzeff et al.,1984; Suntharasamai et al., 1986。1985年欧洲批准法国Sanofi Pasteur研制的纯化的Vero细胞狂犬病疫苗(purified Vero cellculture rabies vaccine,PVRV),并在欧洲和很多发展中国家,如印度和中国获得批准并大量生产。 Vero细胞的一个优点是可以在微载体上生长和感染,并在发酵罐中培养,用于生产大量含有狂犬病毒的组织培养液。

WHO参考Vero细胞库是134代,用于生产的最大工作细胞代次是150代,研究显示Vero细胞传到169代仍无致瘤性。取工作细胞库中的一支或几支细胞复苏、扩增至国家管理当局批准的细胞代次用于疫苗生产。将复苏后的细胞用胰蛋白酶或其他适宜的消化液进行消化,分散成均匀的细胞,加入适宜的培养液混合均匀,置37℃培养成均匀单层细胞,而后传代至种毒的细胞代次。

PVRV的狂犬病毒株与HDCV生产所用的病毒株相同。细胞生长在生物反应器中,常规可以获得107的滴度。使用区带离心和超滤法对收获的病毒原液进行浓缩和纯化,然后使用β-丙内酯灭活。最终的产品中含有人白蛋白。临床研究显示,初次和加强注射PVRV后的RVNA应答与使用HDCV进行暴露前和暴露后免疫的应答相当。泰国和中国的研究显示其可用于严重暴露后的预防,并且没有发现严重的异常反应。

人们研制了层析纯化Vero细胞培养狂犬病疫苗(chromatically purified Verocell culture rabies vaccine,CPRV)的方法,以减少细胞DNA和外源蛋白的含量。该疫苗耐受性良好,具有强免疫原性,只比HDCV略差。在菲律宾,CPRV成功用于严重的狂犬病毒暴露预防。Vero细胞狂犬病疫苗也已使用无血清细胞培养基质进行生产。

永生细胞系具有几乎无限的生长能力,并且易于大规模培养用于工业生产,但可能被认为具有致癌性。理论上讲,体内癌症发生可能由于引入单个细胞或功能性的致癌转录单元插入正常的体细胞染色体。将此细胞株用于疫苗生产需要谨慎考虑。多年来,Vero细胞狂犬病疫苗得到WHO和欧盟的肯定,在全球范围内广泛使用,但是在美国还未获得批准。

   如果用VERO细胞系进行病毒增殖,《欧洲药典》第6版和WHO都规定,在每1个人用剂量的疫苗中,残留宿主细胞DNA含量不应高于10ng。欧洲和亚洲总共有数十亿人次在数十年间使用过用VERO细胞生产的各种疫苗 (包括狂犬病疫苗)使用记录的统计分析结果证明:在限定传代次数和DNA残余含量的前提下,VERO细胞在实际上与对照相比并不增加致癌性。 用该细胞生产的疫苗实际上是安全的,不会致癌。

  WHO多年来一直支持用VERO细胞生产多种疫苗。WHO不久前仍正式肯定并推荐用VERO细胞生产疫苗。WHO有一段时间曾将该细胞DNA残留量的标准提高到100pg/剂,结果立即造成世界上相关疫苗的价格上涨甚至造成严重的市场短缺。综合权衡利弊,WHO近年又将DNA残留的标准仍恢复到原来的标准10ng/剂,认为这样做利大于弊。



与动物神经组织培养方法成为鲜明的对比,一支小的冻存管内的Vero细胞即可以无限繁殖,能够以低廉的价格进行大规模工业化生产。 Vero细胞按工业规模每批次可以生产约6000升,勿需浓缩,可分装成超过1200万剂PVRV (每剂为0.5毫升)(Wuet al., 2011)。

④ 纯化鸡胚细胞(purified chick embryo-cell culture,PCEC)

人们对Novartis(Chiron Behring)公司制造的纯化鸡胚细胞培养疫苗(PCECV)和HDCV对动物和人类的暴露后保护效果进行了评估比较,两种疫苗产生的保护作用没有显著差异。为了制备PCECV,人们将Flury LEP-C25病毒株在原代鸡胚成纤维细胞中培养。病毒使用0.025% β-丙内酯灭活,然后使用密度梯度离心法浓缩并纯化。真空冻干疫苗含有处理过的明胶作为稳定剂。PCECV已在全世界注册,包括美国,并且已经使用了8,000万剂。复溶研究显示,用水复溶后的疫苗在冰箱中至少1周内可以保持稳定(王月等,2012)。

在美国、德国、英国、泰国、克罗地亚和印度,人们对PCECV进行了广泛的实验。印度使用PCECV已经超过10年,疫苗的耐受性良好;其中在1375名使用者中只有4%报告有反应,尽管也曾观察到一些荨麻疹病例。疫苗的免疫原性良好,暴露后预防的中和抗体几何平均滴度(GMT)约为4 IU,只有0.9%的患者其抗体滴度低于1 IU。

PCECV以商品名RabAvert在美国注册。尽管在美国没有注册皮下注射使用,但疫苗在其他国家仍可进行皮下注射。日本采用Flury HEP株生产了一种类似的疫苗,但使用范围较窄。接种PCECV疫苗者可以产生针对黄热病疫苗的阳性皮肤反应,可能是由两种疫苗都含有鸡蛋蛋白,对鸡蛋过敏者应慎用这两种疫苗。

44.7.2 细胞制备、管理和检定

培养基及添加辅料在细胞培养阶段,培养基中可以添加最低有效浓度的抗生素,所加抗生素的种类应经批准,在疫苗生产的任何阶段均不能添加青霉素及其他β~内酰胺类抗生素。培养基中可以添加无毒的pH值指示剂如0.002%的酚红。

培养用牛血清应来源于无牛海绵状脑病地区的健康牛群,其质量应符合《中国药典》2010版的有关规定(国家药典委员会,2010)。目前,国际上鼓励采用无血清、无动物源性成分的培养基,降低动物源性的感染性污染的风险。消化细胞用的胰蛋白酶应证明无外源性或内源性病毒污染,应证明其没有污染真菌、细菌和支原体。目前已有基因工程表达的胰酶上市,应能有效防止动物源性感染微生物的污染。细胞培养基应无真菌、细菌和支原体污染,疫苗生产全过程不得添加人血清,目的是排除人源病毒的污染。

地鼠肾细胞为原代细胞,在消化、培养后直接用于病毒的接种。Vero细胞为传代细胞,生产企业引进Vero细胞后应建立主细胞库和工作细胞库,按照“生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”检定合格后才可用于疫苗生产。从工作细胞库中取1支或几支细胞经复苏、多次传代至国家药品管理部门批准的种毒的细胞代次。细胞传代比例应按疫苗研发时确定细胞致瘤试验和有效细胞终末代次研究时相同的传代比例,不能在疫苗生产时任意提高传代比例。细胞扩增时需要经过多次传代,为获得高病毒滴度,接种病毒时的细胞要处于对数生长期。

 Vero细胞DNA残留量测定:由于目前人用狂犬病疫苗均不含有氢氧化铝佐剂,因此,《中国药典》三部2010版将DNA残留量测定由原液检定纳入成品检测,规定应不高于100pg/剂(附录IX B)。《欧洲药典》7.0和WHO规定应不高于10ng/剂。采用分子杂交技术检测DNA残留,常采用地高辛标记核酸探针,用光标记法将光敏Dig标记到探针上,制成光敏Dig-核酸探针,再与固定在硝酸膜上的靶核酸进行靶DNA分子杂交,使之与抗Dig-碱性磷酸酶结合,最后用显色检测,灵敏度可达10pg。

Vero细胞宿主蛋白残留量测定:宿主蛋白残留量采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定供试品中的Vero细胞残余蛋白含量,并以参考品为标准采用直线回归法计算Vero细胞残余蛋白含量。线性范围:12.5-400ng/ml,灵敏度:12.5ng/ml,定量限度:50ng/ml,准确度在靶值±2SD范围内。如果用Vero细胞生产的疫苗, 宿主蛋白残留量不高于4μg/ml;如果用地鼠肾细胞生产的疫苗宿主蛋白残留量应不高于24μg/剂。WHO和《欧洲药典》7.0对基质细胞残留蛋白含量没有做明确限度要求 (EDQM 2010)


 



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1 孙学军

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