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肥胖细菌狩猎记(二) 精选

已有 9171 次阅读 2012-12-17 09:10 |个人分类:肠道菌与健康|系统分类:科研笔记|关键词:肥胖,肠道细菌| 肥胖, 肠道细菌

        博主按:2005年把肠道菌群的工作开始向肥胖聚焦时,我就坚信,一定会找到一些具体的细菌种类,它们在肥胖的发生中起着关键作用,或者促进肥胖,或者抑制肥胖。 8年连续不懈的努力,终于把第一个这样的细菌验明正身。有了这个方法,会有更多的与肥胖直接相关的细菌被发现,并可以研究清楚这些细菌参与肥胖发生、发展的分子机理,为肥胖和相关代谢病的预防和治疗提供新的靶点。

        
 “这是第一次证明人体肠道里有些条件致病菌的确有引起肥胖的能力,它们在肥胖症患者肠道里过度生长是肥胖的原因,而不是结果。”

        该论文2012年12月13日在线发表在ISME Journal,很快成为ISMEJ网站被下载最多的10篇论文的第一名。
       http://www.nature.com/ismej/topten/index.html

       
该论文以开放获取模式发表,欢迎免费下载。
       
       不要忘记下载附录,那里面有大量的数据啊。先进入下面的网页,然后找到Dec 13在线发表的论文列表,翻到最后,找到本文的题目:
An opportunistic pathogen isolated from the gut of an obese human causes obesity in germfree mice
就可以下载正文和附录了:
http://www.nature.com/ismej/journal/vaop/ncurrent/index.html#13122012

                                                                 肥胖菌狩猎记(二)

                                                                           上海交大 赵立平

        2006年,戈登实验室在同一期Nature杂志刊登两篇论文,分别在小鼠和人体的肠道菌群中发现与肥胖相关的共同的特征:肥胖的人或者小鼠肠道菌群中,厚壁菌门相对类杆菌门的比例很高,换句话说,厚壁菌门的细菌多,类杆菌门的细菌少。这个比例后来在有关论文里常被简称为FP比值。他们发现,无论高脂饲料诱导的肥胖小鼠,还是瘦素基因缺失的遗传性肥胖的小鼠,其肠道菌群中的FP比值都比健康的瘦的小鼠高。他们也发现肥胖症患者肠道菌群的F/B比值也比健康人高,当肥胖患者通过低脂肪或者低碳水化合物饮食减肥以后,FP比值回逐步降低到与健康的瘦的志愿者一样的水平。

      这个发现发表后,引起了广泛的重视,很多课题组在与肥胖有关的研究中,如果要测定菌群结构,都开始关注F/B比值,有的干脆就用定量PCR的方法直接测定这两个门的比例,而不再关注肠道菌群的精细结构在肥胖和瘦的个体间的差别了。

       看到这个结果以后,我的第一个反应就是:值得怀疑。为什么?

       微生物象大生物一样,其分类也遵循:门、纲、目、科、属、种的从高到低的各级分类单元。“门”是一个很高的分类单元,目前地球上所有的细菌被分成70个左右的“门”,可见很多差别很大的细菌是被归在一个“门”里的。

        肠道菌群虽然有上千种,但是,只有89个最常见的门。而厚壁菌门和类杆菌门合起来就占到总菌量的95%左右。把所有属于厚壁菌门的细菌合并在一起与所有属于类杆菌门的细菌求出一个比值,认为与肥胖的发生有关系,这里面隐含了一个不合逻辑的假定:所有属于厚壁菌门的细菌在肥胖时都增加,在减重后都减少,所有属于类杆菌门的细菌在肥胖时都减少,在减重后都增加。作为一个研究微生物生态多年的人,知道同一个门的细菌可以对环境条件的变化有非常不同的反应,有的会加快生长,有的则会放慢生长,想让它们齐步走是不可能的。

         戈登教授在2006年那篇报道肥胖患者减肥以后F/B比值变得与瘦人一样的Nature论文的后面指出:这是第一次发现在“门”这样一个很高的分类单元里的不同细菌可以共享一种与宿主健康有关的功能。言外之意,下一步就是要把这个同一个门里的不同细菌都具有的“功能”找出来。当然,这也是最终确定F/B比值真的与肥胖有关系的最重要的证据。但时至今日,这个“功能”也还没有找到。

        怀疑归怀疑,没有实验证据是很难对这个结论提出挑战的。虽然在公开场合不适宜质疑这个结论,但我心中有数,不能太把这个结论当回事,要继续走自己的路,在实验室内部的组会上或讨论课题时,我经常提醒学生们,要保持头脑清醒,别被Nature发表的结论吓糊涂了,走入歧途。

        可是,走自己的路谈何容易。科学家都是在黑暗中摸索前进的,要想走得快、不摔交、不迷路,除了要有清醒的头脑,还得有得力的工具才行。

        要找到与肥胖相关的细菌,可以采用两个策略:一个是横断面研究,就是比较肥胖病人的肠道菌群与健康人的差别,另一个是纵向跟踪式的研究,就是监测同一个个体在从健康到肥胖或者从肥胖到健康的过程中菌群结构的变化,看哪些种类总是在肥胖的个体里多一些或者在健康的肠道里多一些。做这种相关分析,需要两个技术非常过关,第一,必须能把肠道样品中的几千种细菌的丰度测定出来;第二,必须用多变量统计方法去处理数据,把与肥胖相关的菌群结构模式找出来。

       2005年人类微生物组巴黎圆桌会议宣布要做人体共生菌群测序时,我们实验室的主要工具是DGGE指纹图技术和克隆文库测序技术。DGGE技术前面说过分辨率和通量都比较低,想做大量样品的比较是很难的。不过,我们实验室从博士生高平平、张学礼开始,用这个技术分析废水处理反应器的菌群结构,取得了很好的结果,张学礼甚至解决了一个从1993DGGE技术用于微生物群落结构分析以来一致没能很好解决的单链DNA污染问题,并发表了一篇改进方法的SCI论文。我们实验室很快就成了国际上用DGGE技术分析菌群结构比较好的实验室之一。我们论文中的DGGE图谱干净、优美,审稿人一看就喜欢。不过,后来发现,国际上发表的DGGE图谱都开始有统计分析的结果。我们这一块成了短板。另外,用克隆文库通过测定16SrRNA基因多样性的方法测定菌群的结构也从少量样品的多样性测定,要开始向多个样品间的比较过渡。这类问题的特点是变量数远远大于样本数,需要用特殊的多元统计的方法进行模式识别,我们组里没有人懂得这个技术。

      就在这时,一个很重要的人物登场了。她就是青年学者张梦晖。张梦晖2005年从比利时布鲁塞尔自由大学博士毕业,专业是化学计量学,专门是处理各种分析仪器产生的大量数据的模式识别问题。她的导师是这个领域的开拓者之一。张梦晖在上海找工作时,先找了我的老搭档贾伟教授。不过,药学院以编制紧张,一个组只能有一个助手为由,回绝了贾伟的进人申请。贾伟给我打电话,问是不是可以让张梦晖进生命学院。一听这个求职者的背景,我大有如获至宝的感觉。立马去请示罗九甫书记,是否可以把张梦晖进到我的组里,尽管我的组里青年教师已经比较多了,罗书记了解到张梦晖对我们工作的重要性后,非常支持,表示可以给编制。这样,我就把张梦晖约到我在徐家汇的办公室见面,谈了10分钟,就告诉她可以办入职手续了。对于这么顺利进交大,张梦晖当时挺感到意外,不过,现在她该明白为什么了。

      张梦晖来了以后,把多元统计方法用到DGGE图谱和克隆文库数据的模式识别上,给我们带来了很多新的进展。例如,当时,国际上已经开始出现454焦磷酸测序这样的高通量测序的工作,可以一次获得多个样品的DNA序列多样性测定结果。如何对多个样本的微生物多样性进行比较,找出有意义的差别,就成为一个很重要的技术瓶颈。张梦晖带着博士生张美玲,用PLS-DARDA这样的统计方法,对轮状病毒感染导致腹泻的儿童肠道菌群样品和健康对照的类杆菌属的克隆文库数据进行了对比分析,发现了与疾病相关的关键种类。这个工作发表到欧洲微生物学会联合会的微生物生态学杂志。虽然处理的数据不大,但却是有代表性的数据集,为日后我们处理规模比较大的454测序数据奠定了统计方法的基础。张梦晖自己觉着,这些统计学方法都是很经典的,对她来说没有什么难度。但实际上,把这些方法用到微生物生态学领域的DNA测序数据的处理,还是需要做些重要的改进和适应工作的。她带来的方法直到现在还是这个领域最好的方法之一。

        虽然,我对戈登实验室F/B比值与肥胖相关的结论心存疑虑,但是,要说服自己和实验室的学生、老师,去寻找与肥胖相关的具体细菌种类,需要对肠道菌群与人体健康的关系先做一些深入的分析。要想办法看到肠道菌群里面的一些细菌种类对人的健康的影响比别的种类要更大。也就是说,要研究肠道菌群与人的健康的关系,就一定要具体分析不同种类的表现,而不能不分青红皂白,把很不一样的细菌合在一起,观察它们的行为。

        用什么办法才能看到肠道细菌里面的不同种类对人体的健康影响不一样呢?

        200410月,应杨胜利教授的邀请,我在上海参加了一场学术报告会,报告人是英国帝国理工的尼克尔森教授。在这之前,我曾经看到过他写的一篇综述,讲到肠道菌群与人体的基因一起决定人的代谢特性,应该重视肠道菌群在药物疗效和毒性中的作用。在看到这篇综述时,我很兴奋,有一种终于找到知音的感觉。所以,收到杨院士的邮件后,我就急切地去维斯汀酒店参加报告会了。

        参加报告会的大约有20多人,都是经过特别邀请的。尼克尔森讲话很快,标准的伦敦口音,但喜欢暴点小粗口,常常冒出bloody之类的词,那种直言快语的风格,不像个英国绅士,到像个美国教授。报告的内容令人大开眼界。他一开始就强调肠道菌群与人体健康的关系,在讲座中也不断地提到肠道菌群参与药物代谢和毒性的例子。我问了他几个与肠道菌群有关的问题,立马引起了他的注意。报告后,杨老师宴请尼克尔森,我是陪吃之一。席间,尼克尔森又主动提起肠道菌群的话题。他说,自己上大学时,不喜欢微生物学,而是学了海洋动物,后来又做核磁共振,然后用核磁共振分析人和动物的尿液、血液里的代谢物组成谱,他把这个新的方向叫做metabonomics(代谢组学)。他是这个领域的开拓者,也有人称他为“代谢组学之父”。我们也跟着这么说了一段时间,后来觉着有点肉麻,而且,好像“之父”之类的称号,一般是过世后才封的,所以,后来也就不叫了。不过,这位老兄的学术功底和贡献的确是“之父”级的,这到不用怀疑。席间,他说自己没有想到,分析尿液样品时,发现里面有不少是肠道菌群产生的代谢物,例如,有些杂环类和芳香类的化合物一看结构,就知道是肠道菌群产生的,因为人的基因组里就没有编码产生这些代谢物的基因。他们分析了同一个品系、遗传背景一样,但对同一种药物的反应不一样的动物的尿液样品的代谢物谱,结果发现,细菌产生的代谢物可以把这两组动物区别开,但动物自己的代谢物不行,这就提示,在宿主遗传背景一样的前提下,对药物代谢的不同,恐怕是细菌在作怪。这样的例子越看越多,尼克尔森坐不住了,只好捡起大学里不喜欢的微生物学,开始从代谢的角度研究肠道菌群与人体健康的关系。他们很快发现,用尿液代谢物谱或者血清代谢物谱的差别,可以区别冠心病人和健康人、区别高血压病人和健康人,甚至可以区别健康的中国人、美国人和日本人,他们发现在数百种代谢物中,能够把不同健康状况和不同地区的人群区别开的代谢物有不少是肠道菌群产生的,这就说明,肠道菌群可能直接或者间接地参与了人体的代谢过程,最终影响到了人体的代谢,而每个人的代谢特征是可以用他的尿液代谢物谱来反映的。尼克尔森实验室在代谢组学领域做了很多开创性的工作,从2005年以来,在Nature上发表多篇论文,在国际上享有盛名。

        那顿饭吃了多长时间记不得了,吃的什么更是记不得了,只是记得与尼克尔森一直热烈地讨论肠道菌群的话题,大有相见恨晚的感觉。

         分手时,我希望邀请他到交大访问,那时,我在帮陈竺和杨胜利两位老师在交大推动系统生物学的研究,尼克尔森围绕完整人体做的工作显然是一种典型的“自上而下”的整体的系统生物学,与国际上由胡德教授登开创的以细胞内的生物网络为核心的自下而上的系统生物学相得益彰。同时,他的代谢组学和整体系统生物学与生态学的系统观是不谋而合的,而且又通过测定肠道菌群的代谢物,可以监测其功能“脚印”,对于研究肠道菌群的结构变化与宿主健康的关系,自然十分重要。

        自那次见面以后,尼克尔森应我们的邀请,经常来中国访问、讲学,每次我们见面,都有说不完的话,谈起菌群和健康的关系,各抒己见,谈笑风生,很是痛快。

        在经过多次的交流以后,我们觉着应该一起做个项目,好好看看肠道菌群到底怎么影响人体的代谢。2006年春天,经杨院士提议,我们邀请尼克尔森教授访问杭州,由著名的感染微生态学家李兰娟教授做东,召开了一次系统生物学讨论会,陈竺老师也出席了会议。这次会议对于我们通过国际合作,在肠道菌群与健康领域开拓一个新的路子,起到了催化剂的作用。

        会后,我们邀请李兰娟老师到人类基因组南方中心,与赵国屏老师一起讨论了一个方案:用一个四世同堂的7口之家作为样本,每隔一个月采集一次粪便和尿液样品,通过分析尿液中的代谢物谱和肠道中的菌群组成,看看,肠道菌群在不同个体之间和同一个个体的不同时间点之间的种类组成的变化与尿液中的各种代谢物的浓度的变化之间有无相关性。这里的假定是:如果一种细菌对人体健康很重要,它在不同个体间的有无和多少的变化,以及在同一个个体不同时间点的变化就会造成人的代谢的变化,而人的代谢的变化可以从其排出的尿液中的代谢物的组成的变化反映出来。有了这个方案以后,我们就开始采样,准备分析数据和处理数据。

        这个课题是我的博士生李旻和李老师的博士生王宝红共同来作的。李旻是第二医科大学临床医学毕业,经郭晓奎教授推荐免试入学到我这里读博的。她是我们招收的第一个有医学背景的博士生。记得在南方中心的会议以后,我要求她写一个会议纪要。纪要给我后,让我眼睛一亮,写的非常好,思路清晰,文笔优美,真是个才女。李旻后来果然表现出色,发了很好的论文,现在在美国伊利诺伊大学香槟校区做博士后。这么多年的经验表明,能写一手好文章的学生是有培养前途的。

        长话短说,这个项目在李老师的关心下,王宝红采到了所有的样品。粪便样品在上海我的实验室分析菌群结构,主要用了两种方法:一是DGGE,二是克隆文库测序。DGGE图谱尽可能做到定量,而且把所有主要的条带都做了测序鉴定,工作量十分浩大;测序工作在南方中心进行,每个样品做了1000条测序,在当时已经是大数据了。生物信息分析我们自己做,当时在实验室工作的周豪魁同学为此立下汗马功劳;尿液样品送到科学院武汉数学物理所,由唐惠儒研究员的实验室做代谢组学分析。惠儒是尼克尔森实验室管理核磁共振平台的“技术管家”,科学院百人计划引进的。在项目筹备阶段他也多次回国参加了交流和讨论。所有数据出来以后,张梦晖带着数据去尼克尔森实验室与博士生玛梯阿斯一起进行了菌群种类组成和代谢物数据的关联分析,结果显示,具体的肠道菌群种类的变化与尿液中的特定的代谢物种类是有互动关联关系的。在这个试验里,我们一共找到10种肠道细菌,每一种至少与一种尿液的代谢物有关联关系,多数是正相关,也就是说,肠道里一种细菌数量增加,尿液里至少一种代谢物的浓度也会增加。有一种细菌甚至与8种代谢物有关联,说明它可以广泛影响人体代谢,这种菌正好是人的肠道里占优势的能够产生丁酸盐的有益菌。也就是说,肠道里的具体的某种细菌的变化会影响到尿液里的具体的代谢物的变化,而且同一个门里的细菌,对代谢的影响不一样。提示我们,原来的想法是有道理的。这时,工作进入快车道。尼克尔森经常带着助手和学生来上海进行数据的深入分析和讨论,在差不多一年半的时间里,他来上海9次。

        论文由我执笔,主要与尼克尔森讨论修改,每改好一稿,发给所有的人修改。记得有一次我们两人在咖啡厅里改稿子,由于太专心,稿子的一角碰到旁边的蜡烛也没有发现,等到火苗起来了,才看见,赶紧把咖啡倒上去扑灭,手忙脚乱之后,我们开心的大笑。这篇被烧掉一角的手稿后来被我收藏起来留作纪念了。经过几个月的努力,终于把文章投到NatureNature编辑部3天就送审了。苦苦等了3个月,结果是退稿。看看审稿人的意见,很多没有道理,于是,我们写了一封很长的申诉信回去。最后,编辑同意修改后再投回去。但是,我们担心这么拖下去,会被其他人抢先发表类似的结果。于是,在陈竺老师的推荐下,论文顺利被美国科学院院刊PNAS接受,于2008年春节期间在线发表。论文发表后,很快得到学术界的关注,连续2个月位于PNAS网站50篇被阅读最多的论文榜。自然杂志的微生物学评论刊物的主编给我和尼克尔森来信,要把论文作为亮点进行评论。他的题目就是:who dose what in the gut microbiome? 大意是说,这篇论文建立了一种方法,可以很快知道哪种细菌会影响人体的哪一部份代谢。这篇论文发表后,很快就超过100次引用,被科技部信息所评为当年的百篇优秀国际学术论文。这个论文是国内外五家单位共同合作的结果,是国际合作的一个成功案例。

       对我来说,这个工作给了一个重要的启发:肠道细菌的确不是在“门”的水平影响人体的健康,而是同一个门里的不同的细菌发挥着不同的作用,不能把它们合在一起找与肥胖的关系,需要在“种”的水平上找关系。

       但是,这个工作是一个小样本的试验,所用的方法是不能做大样本的。如果我们不能解决一次定量测定几千种细菌的方法问题,想把与肥胖有关的细菌找出来几乎是不可能的。

       454焦磷酸测序技术的出现,为解决这个问题带来了曙光。

       454测序技术是新一代测序技术的代表之一。这个技术一次可以测定几十万条序列,每个碱基的测定成本大幅度降低,一台机器的测序能力抵得上100台老一代的桑戈测序仪。不过,要把这个方法用到菌群样品的测序,需要解决如何一次测定几百个样品还能把每条序列是从哪个样本来的分辨清楚的问题。

        20068月,我到维也纳参加国际微生物生态学大会,在大会上被选为学会的常务理事。会议结束后,我去瑞典访问了詹森教授,她也是微生物生态学领域很活跃地做菌群的专家。在那里我了解到,当时已经有人把每个样品在做PCR扩增时,引物前面加一段特殊的标记序列叫barcode,有点像商品上的条形识别码。这样,就可以把几百个样品混在一起做一次454测序,然后把几十万条序列按照识别码的不同进行分配,最后,就可以一次拿到几百个样品的序列,每个样品可以测定上千条,足以用序列的多样性组成来反映样品里的微生物的种类组成。据他们讲,这个思路是他们最先提出来的,但还没有来得及发表,就被别人抢先了,很是郁闷。

        得到这个消息,我长出了一口气,我们寻找肥胖细菌需要的技术终于具备了!接下来的任务,就是尽快通过做一个小项目,把这个技术方法在我们实验室建立起来。

         这个任务,就落在了新入学的博士生张晨虹身上。

菌群影响人体代谢的论文,可以在此下载:

http://www.pnas.org/content/105/6/2117.full?sid=265f9807-d295-4fd1-a3c0-ae777475558f




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