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[转载]T4 DNA连接酶
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T4 DNA连接酶是一种封闭DNA链上切口的酶，借助ATP或NADP水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化形成磷酸二酯键。T4 DNA连接酶不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的DNA的连接，也可以催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接。T4 DNA连接酶可以修补双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂合物上的单链缺口(single-strand nicks)，在分子生物学中有广泛的应用。
T4 DNA连接酶作用机制：T4 DNA连接酶是一单链多肽，分子量为68,000道尔顿，它能催化双链DNA上相邻的3ˊ羟基和5ˊ磷酸末断形成磷酸二脂键。λDNA用EcoRI酶切割后形成的6个片断均具有粘性末端（cohesive ends），在T4 DNA连接酶作用下，可连接成原来的线状DNA。
T4 DNA连接酶是经原核表达、柱层析纯化获得的高纯酶，SDS-PAGE显示为一条62kD的蛋白条带，适用于DNA片断连接、克隆等各种反应。连接条件：推荐在10~20μl反应体系中进行，反应中DNA浓度最大可达1mM（相当于1kb DNA约1mg/ml）。首先混合要连接的DNA片段，加入10× Ligase Buffer至终浓度为1×，再加入适量T4 DNA Ligase混匀，最适连接温度为16℃。粘末端连接效率较高，加入0.2~1μl T4 DNA Ligase，可在室温或16℃反应1~3小时完成；平末端连接效率较低，加入1μl T4 DNA Ligase，通常需要在16℃或4℃过夜完成反应。
注意事项：
1)10× Ligase Buffer含有ATP，使用前应在室温放置至融化或用手掌温度辅助融化，然后置于冰上。不要加热融化以免ATP降解。
2)T4 DNA Ligase对热敏感，容易失活。使用时应放置冰上，用后立即置冰箱中冷冻保存。
3)如需在连接反应后灭活T4 DNA Ligase，可于65℃孵育10min即可。
4)10× Ligase Buffer不宜反复冻融，建议分装使用。
5)配制过程不要剧烈震荡，使用移液器混匀，不要使用振荡器
应用
1.粘性末端或平末端双链DNA的连接；
2.双链寡核苷酸接头与双链DNA连接；
3.双链DNA、RNA或DNA-RNA复合体中缺口的修复；
4.连接酶介导的RNA检测；
5.位点特异性突变；扩增片段长度多态性。
DNA连接酶对单个核苷酸差异具有很强的鉴别能力，其核心在于它可以把与模板完全配对的两相邻寡核苷酸片段连接起来，如果连接处出现一个碱基错配，连接反应就不能进行。以该酶为基础的技术如空隙-连接酶链反应(gap ligase chain reaction,Gap-LCR)和连接酶检测反应(ligase detection reaction,LDR)在低丰度基因单核苷酸差异检测方面具有很强的应用潜力。
在妊娠过程中母体血浆中存在游离胎儿DNA，这一发现为基于母体外周血的无创性产前诊断开辟了新的领域。胎儿DNA一半来自于母亲，另一半来自于父亲，目前已报道利用母体血浆DNA来检测胎儿父系来源的致病基因，可应用于父亲为常染色体显性遗传病患者的胎儿无创性产前诊断，而且将这种检测方法应用于父亲为常染色体隐性遗传病携带者的产前诊断，也可使50%的胎儿避免了传统的绒毛吸取或羊膜腔穿刺检查。但由于母体血浆总DNA量少，且在血浆总DNA中胎儿DNA所占的比例甚微，母体等位DNA片段可干扰胎儿DNA的检测，因此对这种低丰度胎儿DNA检测必须采用高灵敏度和高特异性的分析系统。点突变或单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的检测是目前DNA分子诊断中的主要研究内容，对母体血浆中的这些单核苷酸差异的检测在技术上要求更高，目前所用的检测方法仍不够理想。DNA连接酶对单个核苷酸差异具有很强的鉴别能力，其核心在于它可以把与模板完全配对的两相邻寡核苷酸片段连接起来，如果连接处出现一个碱基错配，连接反应就不能进行。
参考文献
[1]Restriction endonuclease[J]. Raymond J. Williams. Molecular Biotechnology. 2003(3)
[2]Estrogen Receptor Alpha Gene Polymorphisms and Breast Cancer Risk[J]. Aesun Shin, Daehee Kang, Hisahide Nishio, Myeong Jin Lee, Sue Kyung Park, Sook-Un Kim, Dong-Young Noh, Kuk-Jin Choe, Se-Hyun Ahn, Ari Hirvonen, Ju Han Kim, Keun-Young Yoo. Breast Cancer Research and Treatment. 2003(1)
[3]Evaluation of bidirectional transfer of plasma DNA through placenta[J]. Akihiko Sekizawa, Kaori Yokokawa, Yumi Sugito, Mariko Iwasaki, Yasuo Yukimoto, Kiyotake Ichizuka, Hiroshi Saito, Takashi Okai. Human Genetics. 2003(4)
[4]Maternal serum cell-free fetal DNA levels are increased in cases of trisomy 13 but not trisomy 18[J]. Tuangsit Wataganara, Erik S.LeShane, Antonio Farina, Geralyn M. Messerlian, Thomas Lee, Jacob A. Canick, Diana W. Bianchi. Human Genetics. 2003(2)
[5]Fetal gender determination in early pregnancy through qualitative and quantitative analysis of fetal DNA in maternal serum[J]. Hiroshi Honda, Norio Miharu, Yoko Ohashi, Osamu Samura, Masayuki Kinutani, Tetsuaki Hara, Koso Ohama. Human Genetics. 2002(1)
[6]Birth of Healthy Children After Preimplantation Diagnosis of Thalassemias[J]. A.Kuliev, S.Rechitsky, O.Verlinsky, V.Ivakhnenko, J.Cieslak, S.Evsikov, G.Wolf, M. Angastiniotis, G.Kalakoutis, C.Strom, Y.Verlinsky. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 1999(4)
[7]Preimplantation Diagnosis of Thalassemias[J]. A.Kuliev, S.Rechitsky, O.Verlinsky, V.Ivakhnenko, S.Evsikov, G.Wolf, M.Angastiniotis, D.Georghiou, V.Kukharenko, C.Strom, Y.Verlinsky. Journal of Assisted Reproduction and Genetics.1998(5)
[8]易萍. 母体血浆中胎儿DNA点突变新型检测技术在无创性产前诊断中价值的研究[D]. 第三军医大学, 2006.
以上摘自https://www.chemicalbook.com/NewsInfo_7458.htm
连接酶
连接酶（Ligase，又称连结酶、结合酶、合成酶），是一种催化两种大型分子以一种新的化学键结合一起的酶，此反应与ATP的分解反应相偶联。在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷（ATP）高能磷酸键的断裂。
一、DNA连接酶
DNA连接酶最早于1967年由三个实验室同时发现，经过科学家几十年的研究发现，目前在病毒、细菌和真核生物体内都发现了DNA连接酶，不同类型的DNA连接酶的作用机制不同。一般情况下，根据DNA连接酶催化反应所需的能量来源可以把DNA连接酶分为腺苷三磷酸（ATP）依赖型和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖型，腺苷三磷酸依赖型广泛存在于真核生物、古细菌、真细菌和病毒中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖型则分布在古细菌、真细菌和病毒中。
常见种类和作用机制
1、T4 DNA连接酶
T4 DNA连接酶是目前应用比较多的病毒基因组编码的DNA连接酶，在基因重组中广泛使用。噬菌体类型较多，目前研究发现T4噬菌体能够合成T4 DNA连接酶，并且已经能够从被T4嗜菌体感染的大肠杆菌中提取该酶，此外科学家也已经定位该酶的合成基因，即噬菌体T4的30基因。T4 DNA连接酶具有连接黏性末端和平末端的作用，研究人员总结DNA片段的连接过程，认为整个DNA连接反应可以通过三个连续步骤来完成：
（1）ATP通过断裂最后一个高能磷酸键释放能量，同时产生的AMP和T4 DNA连接酶利用ATP水解释放的能量形成E-AMP复合物；
（2）所形成的E-AMP复合物可以识别DNA双链之前被切开的切口，识别之后AMP会脱离E-AMP复合物并与DNA的5’-P基团结合；
（3）需要连接的另外一段DNA分子片段的3’-OH会攻击第二步形成5’-P-AMP，3’-OH和磷酸基团残基发生反应形成磷酸二酯键，同时释放出一个AMP。
2、 真核生物DNA连接酶
真核生物存在3种ATP依赖型DNA连接酶——DNA连接酶Ⅰ、DNA连接酶Ⅲ和DNA连接酶Ⅳ。研究显示，DNA连接酶Ⅰ和DNA连接酶Ⅳ广泛分布于真核生物中，如植物界和动物界，DNA连接酶Ⅲ则主要分布于脊椎动物中。
目前科学家认为，在真核生物DNA复制过程中，起到连接作用的可能主要是DNA连接酶Ⅰ，DNA连接酶Ⅰ活性的调节与其氨基端有关，在其氨基端靠近活性中心有一个特定的部位，该部位可以通过磷酸化作用来调节DNA连接酶Ⅰ的活性。DNA连接酶Ⅰ的作用就是将DNA复制时复制叉处形成的不连续的后随链（冈崎片段）连接起来。在此过程中DNA连接酶Ⅰ并不是单独起作用，而是需要和多种蛋白因子密切合作共同完成。在真核生物DNA复制时，后随链是由DNA聚合酶α催化合成的，DNA聚合酶α先催化合成一段引物，然后依赖DNA聚合酶δ与增殖细胞核抗原（持续复制因子），从引物开始合成DNA，然后引物通过降解除去。此外，在损伤的DNA的碱基修复中，DNA连接酶Ⅰ也同样起到重要的作用。首先细胞内的特异性的核酸内切酶和外切酶特异性识别损伤部位，在DNA单链损伤部位的附近进行剪切，切除一段DNA，然后DNA聚合酶以另一条完整的DNA链作为模版进行修复合成，重新合成这段DNA，最后由DNA连接酶Ⅰ将缺口连接。
二、T4 RNA 连接酶
T4 RNA Ligase，即T4 RNA连接酶，是一种ATP-依赖的可以催化单链RNA、单链DNA或单核苷酸分子间或分子内5'-P末端与3'-OH末端之间形成磷酸二酯键的酶。
T4 RNA Ligase主要用于RNA和RNA之间的连接，连接时需要5'磷酸基团和3'羟基的存在。不仅可以进行RNA分子间的连接，也可以进行RNA分子(最短8个碱基)的环化连接。
T4 RNA Ligase可以用于RNA和单核苷酸之间的连接，单核苷酸必须为5'和3'均磷酸化的形式，此时常用于RNA的3'末端标记。
T4 RNA Ligase也可以用于DNA和RNA之间的连接。当DNA提供5'磷酸基团，RNA提供3'羟基时，连接效率较高；当DNA提供3'羟基，RNA提供5'磷酸基团时，连接效率非常低。
T4 RNA Ligase也可以用于DNA和DNA之间的连接，但连接效率非常低。主要用于DNA的环化连接，例如5' RACE中的cDNA环化。DNA和DNA之间的连接尽管可以进行，但比较困难。
https://blog.sciencenet.cn/blog-3431904-1260172.html
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