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自90年代Taqman探针诞生以来,虽然荧光探针(引物)不断有新的技术出现,但是作为一种经典的定量PCR技术,Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选,这主要是因为相对于SYBR荧光染料,Taqman探针具有序列特异性,只结合到互补区,而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系,因此特异性强灵敏度高,而且条件优化容易;而相对于杂交探针,Taqman探针只要设计一条探针,因此探针设计较便宜方便,而且也能完成基本的定量PCR要求。当然Taqman定量方法由于还是要合成探针,也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为:目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验,优化条件→获得曲线数据,比对标准曲线→再重复验证。
第一步:在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过,这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig(重叠群,即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况)内。
第二步:如果其它条件一致,那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了,通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则:
总体原则
先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
所选序列应该高度特异,尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率,而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测,如果不能避免二级结构,那么就要相应提高退火温度。
扩增长度应不超过400bp,理想的最好能在100-150bp内,扩增片段越短,有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
保持GC含量在20%和80%之间,GC富含区容易产生非特异反应,从而会导致扩增效率的降低,以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
为了保证效率和重复性,应避免重复的核苷酸序列,尤其是G(不能有4个连续的G)
将引物和探针互相进行配对检测,以避免二聚体和发卡结构的形成。
引物设计原则
序列选取应在基因的保守区段
避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,避免引物自身形成环状发卡结构
典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。
Tm值在55-65℃(因为60℃核酸外切酶活性最高),GC含量在40%-60%
引物之间的TM相差避免超过2℃
引物的3’端避免使用碱基A,引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基
为避免基因组的扩增,引物设计最好能跨两个外显子。
Taqman探针技术要求片段长度在50bp-150bp
引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。
探针设计原则
探针位置尽可能地靠近上游引物
探针长度应在15-45bp(最好是20-30bp),以保证结合特异性
检测探针的DNA折叠和二级结构
Tm值在65-70℃,通常比引物TM值高5-10℃(至少要5℃),GC含量在40%-70%
探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用,而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。
为确保引物探针的特异性,最好将设计好的序列在blast中核实一次,如果发现有非特异性互补区,建议重新设计引物探针。
Taqman MGB 探针设计
探针的5’端避免出现G,即使探针水解为单个碱基,与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。
Tm值应为65-67℃。
尽量缩短Taqman MGB探针,但探针长度不少于13bp。
尽量避免出现重复的碱基,尤其是G碱基,应避免出现4个或4个以上的G重复出现。
原则上MGB探针只要有一个碱基突变,MGB探针就会检测到(MGB探针将不会与目的片段杂交,不产生荧光信号)。因此,在进行SNP检测时,为了检测到突变子,即Taqman MGB不与目的片段杂交,不产生荧光信号,探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。
注意:为了满足上述要求的4个条件,探针的突变位点可向3’端移动,但突变位点至少在离3’端2个碱基的前方(即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守),以进行SNP检测。反过来,若要进行同类检测,找的是保守片段区,探针中不应有突变位点。若探针即便是只有13个bp,探针仍不完全保守。有几个突变,突变位点也应靠近探针的5’端,这样,即便是突变,探针也可与目的片段杂交,产生荧光信号。另一种方法是设计简并探针,也可达到即使是突变,仍可检测到突变。
第三步:寻找一家信赖的公司合成引物和探针,一般引物合成大家比较熟悉,而且价格也比较便宜(特别是这两年便宜了许多),而探针则相对来说贵了许多,一般Taqman探针合成在1000到5000元不等(不同的合成要求价钱不同)——而这只是标记价钱,序列合成基本上和引物合成价钱相似。
第四、五、六步:一般的定量PCR反应体系与普通PCR其实也差不了多少,只是要加入Taqman探针,另外不同就是分步法的不同。其中需要注意的是:
扩增酶最好选用热启动酶
引物和探针的浓度需要进行优化,有人建议从50nM开始,在50nM—900nM之间优化,一般为200nM(注意探针需要避光保存。
同样Mg+和酶量也需要进行优化,酶的推荐反应浓度是1.25-1.5U(50ul)
DNA模板的添加量通常在100 ng以下,因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同,必要时可进行梯度稀释,确定最佳的DNA模板添加量。如果欲进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应,第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
另外循环参数虽然在引物和探针设计完之后也就确定了,但是有时也需要进行优化。
第七步:在进行数据分析的时候,通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线,然后计算相对方程式。方程式的斜
度可以用来检查PCR的效率,对于100%PCR效率来说,一个理想的斜率是3.32。最佳的标准曲线是建立在PCR的扩增效率为90%-100 %(100%意味着在每个循环之后,模板的总数将增加为前一次的2倍)的基础上。所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数(R2≥0.99) ,这样才能认为实验的过程和数据是可信的。使用这个方程式我们可以计算出未知样本的初始模板量。大多数定量PCR仪都有这样一个软件,它可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
这其中有两种基本的方法:绝对定量和相对定量,研究人员需要根据自己的实验目的来选择。绝对定量是指将未知样品与标准曲线相比较进行分析,一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA样品,要注意得是绝对定量分析的准确性是相对标准品的准确性而言的。相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较,其结果是一个比率,没有确切的数字被检测道。
另外由于不同的样品在反应过程中存在着一定的差异,因此除了要制作标准曲线来进行定量外,还需要设计表达水平相对较为稳定的内参基因来对结果进行标准化。β-actin 和三磷酸甘油醛脱氢酶( Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ,GAPDH) 是两种较常用的管家基因,另外还有cyclophilin,18sr RNA ,phosphoglyserokinase,beta-microglobulin,beta-glucronidase,hypoxanthine ribosyl transferase,transferring receptor 等。要注意这些基因可以被反应条件所影响,在设计定量表达研究时,保证初始对照基因的质量是必要的一步,而且严谨的研究人员会通过对一系列内参基因定量结果取几何平均数来对定量数据进行标准化。
还有一个问题就是如何判断所得到数据的好坏,关于扩增曲线,经验总结认为:
1. 总体看曲线拐点清楚,指数期明显,扩增曲线整体平行性极好,基线平无上扬现象,低浓度样本扩增曲线指数期明显。
2.曲线指数期斜率,反应了扩增效率,越大说明扩增效率越高。扩增效率越高,试剂灵敏度表现会越好。
3.基线,图上的基线也就是阴性样本的扩增曲线,平直或略微下降是好试剂的表现,阴阳性清楚,不易误判。如果有上扬趋势,有可能造成阴性标本误判。
4.曲线与曲线间平行性非常好,说明各反应管扩增效率相近,外标准定量建立在每管扩增效率一样的假定基础上,所以扩增效率越相近,定量的重复性和准确性就越好。而扩增效率相近与否,反应在扩增曲线图上就是曲线的平行性。
5.低浓度曲线指数期明显,一方面不易出现假阴阳性误判,另一方面说明灵敏度高。
大家可以参考探讨。
(生物通:张迪)http://www.ebiotrade.com/newsf/2006-6/200666104922.htm
1/1 | 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柟闂寸绾惧綊鏌熼梻瀵割槮缁炬儳缍婇弻鐔兼⒒鐎靛壊妲紒鐐劤缂嶅﹪寮婚悢鍏尖拻閻庨潧澹婂Σ顔剧磼閻愵剙鍔ゆ繝鈧柆宥呯劦妞ゆ帒鍊归崵鈧柣搴㈠嚬閸欏啫鐣峰畷鍥ь棜閻庯絻鍔嬪Ч妤呮⒑閸︻厼鍔嬮柛銊ョ秺瀹曟劙鎮欏顔藉瘜闂侀潧鐗嗗Λ妤冪箔閹烘挶浜滈柨鏂跨仢瀹撳棛鈧鍠楅悡锟犮€侀弮鍫濋唶闁绘柨寮剁€氬ジ姊绘担鍛婂暈缂佽鍊婚埀顒佸嚬閸o綁宕洪姀鈥崇窞闁归偊鍘鹃崢鍗炩攽閳藉棗鐏犻柣蹇旂箖缁傚秹宕烽鐘碉紲濡炪倖妫侀崑鎰櫠閿旈敮鍋撶憴鍕闁靛牊鎮傞獮鍐閵忋垻鐓撻梺鍓茬厛閸犳洜妲愰悢灏佹斀闁绘ɑ鍓氶崯蹇涙煕閻樻剚娈滈柕鍡楀暣瀹曘劑顢橀崶銊р槈閾绘牠鏌涘☉鍗炲箻妞わ富鍣e娲箰鎼淬垻顦ラ梺绋匡工缂嶅﹪骞冮敓鐘参ㄩ柨鏂垮⒔閻﹀牓姊婚崒姘卞缂佸甯¢弫宥咁吋閸℃洜绠氶梺鍦帛鐢骞夐崫銉х<閺夊牄鍔屽ù顕€鏌熼瑙勬珚闁诡喗绮岃灒闁绘挸瀛╅柨顓熺節閻㈤潧鍓崇紒鑼舵鐓ら柕鍫濐槹閺呮繃銇勮箛鎾村櫢缂佽妫濋弻娑㈩敃閿濆棛顦ュ┑锛勫仒缁瑩寮诲☉銏犵疀闁靛⿵闄勯悵鏇㈡⒑閸濆嫭顥欓柛妤€鍟块~蹇曠磼濡顎撻梺鍛婄☉閿曘儵宕曢幘缁樷拺鐟滅増甯楅弫閬嶆煕閵娿儲璐℃俊鍙夊姍閹瑧鈧稒锚椤庢捇姊洪崨濠冨碍鐎殿喖澧庣槐鐐存償閵婏腹鎷洪梺璇″瀻閸涱垼鍟堟俊鐐€ら崑鍕囬鐐村仼闂佸灝顑呯欢鐐烘煙闁箑骞橀柛姗嗕簼缁绘繈鎮介棃娑楃捕闂佽绻戠换鍫濈暦濠靛棌鍫柛顐ゅ枔閸樿棄鈹戦悩缁樻锭閻庢凹鍓熼幃姗€宕f径瀣伎婵犵數濮撮崯顖炲Φ濠靛鐓欐い鏃€鍎抽崢瀵糕偓娈垮枛閻栧ジ鐛幇顓熷劅妞ゆ柨鍚嬮弳蹇涙⒒閸屾艾鈧兘鎳楅崼鏇炵疇闁规崘顕ч崥褰掓煛瀹ュ骸骞栫紒鐙€鍨堕弻銊╂偆閸屾稑顏�:11 | 婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柛娑橈攻閸欏繘鏌i幋锝嗩棄闁哄绶氶弻娑樷槈濮楀牊鏁鹃梺鍛婄懃缁绘﹢寮婚敐澶婄婵犲灚鍔栫紞妤呮⒑闁偛鑻晶顕€鏌涙繝鍌涘仴妤犵偞鍔栫换婵嬪礃椤忓棗楠勯梻浣稿暱閹碱偊顢栭崶鈺冪煋妞ゆ棃鏁崑鎾舵喆閸曨剛锛橀梺鍛婃⒐閸ㄧ敻顢氶敐澶婇唶闁哄洨鍋熼娲⒑缂佹ḿ鎳冮柟铏姍閻涱噣濮€閵堝棌鎷婚梺绋挎湰閻燂妇绮婇悧鍫涗簻妞ゆ劑鍩勫Σ鎼佹煟閿濆懎妲婚摶锝夋偠濞戞帒澧查柣蹇撳暙閳规垿鎮欓弶鎴犱桓缂佺偓婢樼粔褰掋€侀弴鐔侯浄閻庯綆鍋嗛崢顏堟⒑閸撴彃浜濈紒璇插暣瀹曨垶骞掑Δ浣哄幐闂佸憡鍔戦崝搴㈡櫠濞戙垺鐓涢柛娑卞枤閸欌偓闂佸搫鏈粙鎴﹀煡婢舵劕纭€闁绘劘灏欓鎴炵節閻㈤潧浠滈柣妤€锕幃锟犲灳閹颁焦缍庨梺鎯х箰濠€閬嶆儗濞嗘劗绠鹃柛鈩兠崝銈夋煕閹惧瓨绶叉い顏勫暣婵″爼宕卞Δ鍐ф樊婵$偑鍊х粻鎾翅缚瑜旈、姘舵晲閸℃瑧鐦堝┑顔斤供閸樿棄鈻嶅⿰鍫熲拺闁告稑锕﹂埥澶愭煕婵犲偆鐓肩€规洜澧楅幆鏃堝Ω閵壯冨箳闂佺懓鍚嬮悾顏堝礉瀹€鈧划璇差潩鏉堛劌鏋戦柟鍏兼儗閻撳牓寮繝鍥ㄧ厱闁哄洢鍔岄悘锟犳煟閹惧鈽夋い顓℃硶閹瑰嫰鎮滃鍡橈紒婵犵數鍋涢幊搴∥涘☉姘潟闁圭儤姊圭€氭岸鏌ょ喊鍗炲妞わ絽鎼—鍐Χ鎼粹€茬盎缂備胶绮敃銏ょ嵁閺嶎厼鎹舵い鎾跺枎閺嬪倿姊洪崨濠冨闁稿妫濋弫宥堢疀濞戞瑢鎷绘繛鎾村焹閸嬫挻绻涙担鍐插娴犳岸姊绘担鍛靛湱鈧稈鏅犻幃锟犳晸閻樿尙鐣洪梺姹囧灮鏋い顐㈡嚇閺屾洟宕煎┑鍥舵闂佸綊鏀卞钘夘潖濞差亝鍤掗柕鍫濇噺閻庢儳鈹戦悩顔肩仾闁挎岸鏌嶇紒妯诲磳闁糕晪绻濆畷銊╊敊閹冪闂傚倷绀侀幉锟犲垂椤栫偛纾归柡宥庡亐閸嬫挸顫濋悙顒€顏� | 婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柛娑橈攻閸欏繘鏌i幋锝嗩棄闁哄绶氶弻娑樷槈濮楀牊鏁鹃梺鍛婄懃缁绘﹢寮婚敐澶婄闁挎繂妫Λ鍕⒑閸濆嫷鍎庣紒鑸靛哺瀵鎮㈤崗灏栨嫽闁诲酣娼ф竟濠偽i鍓х<闁绘劦鍓欓崝銈嗐亜椤撶姴鍘寸€殿喖顭烽弫鎰緞婵犲嫮鏉告俊鐐€栫敮濠囨倿閿曞倸纾块柟鍓х帛閳锋垿鏌熼懖鈺佷粶濠碘€炽偢閺屾稒绻濋崒娑樹淮閻庢鍠涢褔鍩ユ径鎰潊闁冲搫鍊瑰▍鍥⒒娴g懓顕滅紒璇插€歌灋婵炴垟鎳為崶顒€唯鐟滃繒澹曢挊澹濆綊鏁愰崨顔藉創閻忓繐绻樺娲川婵犲孩鐣锋繝鐢靛仜閿曘倝顢氶敐鍡欑瘈婵﹩鍘兼禍婊堟⒑缁嬭法绠伴柣銊у厴楠炲繑绻濆顓犲幗闁硅壈鎻徊楣冨汲閳哄懎鍑犳い蹇撳閺€浠嬫煃閵夈劌鐨洪柣顓熺懄閹便劍绻濋崘鈹夸虎閻庤娲﹂崑濠傜暦閻旂⒈鏁嗛柍褜鍓欓埢宥夊Χ閸モ晝锛濇繛杈剧悼閻℃棃宕靛▎鎾寸厽婵°倓鐒︾亸顓熴亜閺囶亞绋荤紒缁樼箓椤繈顢栭埞鐐珚闁哄本娲樺鍕醇濠靛牅鐥梻浣告惈閸婄敻宕戦幘缁樷拻闁稿本鐟ㄩ崗宀€鐥鐐靛煟鐎规洘绮岄埞鎴犫偓锝庡亝濞呮梻绱撻崒姘偓鐑芥倿閿曞倸绀夐柡宥庡幗閸庡孩銇勯弽銊ュ毈婵炲吋鐗楃换娑橆啅椤旇崵鐩庨悗鐟版啞缁诲倿鍩為幋锔藉亹闁圭粯甯╅崝澶愭⒑娴兼瑧鎮奸柛蹇旓耿楠炲啫螖閸涱厾顦ф繝銏f硾閿曪絾绔熼弴銏♀拻濞达絽鎽滅粔鐑樹繆椤愩儲纭剁紒顔肩墛閹峰懘鎼归柅娑氱憹闂備礁鎼粔鏌ュ礉鐎n剚宕查柛鈩冪⊕閻撳繘鏌涢锝囩畵闁逞屽墮閹诧紕绮嬪鍡愬亝闁告劏鏂侀幏娲煟鎼粹剝璐″┑顔炬暬钘熷璺侯儍娴滄粓鏌ㄩ弮鍥跺殭闁诲骏绠撻弻娑㈠煘閸喚浠煎銈嗘尭閵堢ǹ鐣烽崡鐐嶇喖鎳栭埞顑惧€濆缁樼瑹閳ь剙岣胯閸e綊姊洪崨濠佺繁闁搞劍澹嗛弫顕€骞掗弮鍌滐紳闂佺ǹ鏈懝楣冨焵椤掑嫷妫戠紒顔肩墛缁楃喖鍩€椤掆偓閻g兘骞囬弶澶哥炊闂侀潧锛忛崨顖氬脯闂傚倷绀佸﹢閬嶆惞鎼淬劌绐楅柟鎹愵嚙绾惧鏌熺€涙ḿ璐╃憸鐗堝笒缁€鍌炴煕韫囨艾浜圭紒瀣喘濮婄粯鎷呯粙鑳煘濠电偛妯婇崣鍐嚕婵犳碍鏅插璺猴攻椤ユ繈姊洪崷顓€鍦偓娑掓櫊瀹曟洟骞樼紒妯衡偓鍨箾閸繄浠㈤柡瀣枎閳规垿鎮欑拠褍浼愬銈庡亜缁绘帞妲愰幒鎳崇喓鎷犲顔瑰亾閹剧粯鈷戦柟顖嗗懐顔婇梺纭呮珪閹稿墽鍒掗銏犵伋闁哄倶鍎查弬鈧梻浣虹帛閸旀牞銇愰崘顏嗘/鐟滄棃寮婚敐鍛傛棃宕橀妸鎰╁灲閺岋綁鏁愰崶褍骞嬪Δ鐘靛仜濞差厼顕i崼鏇炵閹艰揪绱曢妶璺衡攽閿涘嫬浜奸柛濠冪墵楠炴劙鎳¢妶鍥╃厯闂佺懓顕崑鐔笺€呴弻銉︾厽闁逛即娼ф晶顖炴煕濞嗗繒绠插ǎ鍥э躬椤㈡稑饪伴崘銊ょ帛濠电偛鐡ㄧ划鎾剁不閺嶎厼绠栨俊銈傚亾妞ゎ偅绻堥幃娆擃敆閳ь剟顢旈敓锟� | 婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柛娑橈攻閸欏繘鏌i幋锝嗩棄闁哄绶氶弻娑樷槈濮楀牊鏁鹃梺鍛婄懃缁绘﹢寮婚敐澶婄闁挎繂妫Λ鍕⒑閸濆嫷鍎庣紒鑸靛哺瀵鎮㈤崗灏栨嫽闁诲酣娼ф竟濠偽i鍓х<闁绘劦鍓欓崝銈嗐亜椤撶姴鍘寸€殿喖顭烽弫鎰緞婵犲嫮鏉告俊鐐€栫敮濠囨倿閿曞倸纾块柟鍓х帛閳锋垿鏌熼懖鈺佷粶濠碘€炽偢閺屾稒绻濋崒娑樹淮閻庢鍠涢褔鍩ユ径鎰潊闁冲搫鍊瑰▍鍥⒒娴g懓顕滅紒璇插€歌灋婵炴垟鎳為崶顒€唯鐟滃繒澹曢挊澹濆綊鏁愰崨顔藉創閻忓繐绻樺娲川婵犲孩鐣锋繝鐢靛仜閿曘倝顢氶敐鍡欑瘈婵﹩鍘兼禍婊堟⒑缁嬭法绠伴柣銊у厴楠炲繑绻濆顓犲幗闁硅壈鎻槐鏇熺濞戙垺鐓熼柍鈺佸暞缁€鍫㈢磼椤曞棛鍒伴摶鏍煕濞戝崬鏋撻柟閿嬫そ閺屸剝寰勭仦鎴掓勃婵犮垻鎳撳Λ婵婃闂佹寧娲栭崐褰掑磹閸偅鍙忔慨妤€妫楁禍婊呪偓瑙勬尭濡盯鍩€椤掍緡鍟忛柛鐘崇洴椤㈡俺顦归柛鈹垮劜瀵板嫰骞囬澶嬬秱闂備胶绮摫鐟滄澘鍟扮划濠囶敋閳ь剙顫忕紒妯肩懝闁逞屽墮宀h儻顦抽柣蹇旂懇濮婅櫣绮欓幐搴℃敪婵炲瓨绮犻崜娑㈠礆閹烘梻纾兼俊顖濆亹閻﹀牆鈹戦鏂や緵闁告ɑ鎮傞獮蹇撁洪鍛嫼闂佸憡绋戦敃锕傚煡婢跺娈版い蹇撴噺缂嶆垿鏌嶇紒妯诲磳鐎殿喗鎸抽幃鈺咁敃椤厼顥氶梻浣呵圭换鎰八囬娑氼洸濡わ絽鍟埛鎴犳喐閻楀牆绗氶柨娑氬枔缁辨帡鍩€椤掍焦濯撮柧蹇涒偓娑氱憹闂備礁鎼粔鏌ュ礉鐎n剚宕查柛鈩冪⊕閻撳繘鏌涢锝囩畵闁逞屽墮閹诧紕绮嬪鍡愬亝闁告劏鏂侀幏娲煟鎼粹剝璐″┑顔炬暬钘熷璺侯儍娴滄粓鏌ㄩ弮鍥跺殭闁诲骏绠撻弻娑㈠煘閸喚浠煎銈嗘尭閵堢ǹ鐣烽崡鐐嶇喖鎳栭埞顑惧€濆缁樼瑹閳ь剙岣胯閸e綊姊洪崨濠佺繁闁搞劍澹嗛弫顕€骞掗弮鍌滐紳闂佺ǹ鏈懝楣冨焵椤掑嫷妫戠紒顔肩墛缁楃喖鍩€椤掆偓閻g兘骞囬弶澶哥炊闂侀潧锛忛崨顖氬脯闂傚倷绀佸﹢閬嶆惞鎼淬劌绐楅柟鎹愵嚙绾惧鏌熺€涙ḿ璐╃憸鐗堝笒缁€鍌炴煕韫囨艾浜圭紒瀣喘濮婄粯鎷呯粙鑳煘濠电偛妯婇崣鍐嚕婵犳碍鏅插璺猴攻椤ユ繈姊洪崷顓€鍦偓娑掓櫊瀹曟洟骞樼紒妯衡偓鍨箾閸繄浠㈤柡瀣枎閳规垿鎮欑拠褍浼愬銈庡亜缁绘帞妲愰幒鎳崇喓鎷犲顔瑰亾閹剧粯鈷戦柟顖嗗懐顔婇梺纭呮珪閹稿墽鍒掗銏犵伋闁哄倶鍎查弬鈧梻浣虹帛閸旀牞銇愰崘顏嗘/鐟滄棃寮婚敐鍛傛棃宕橀妸鎰╁灲閺岋綁鏁愰崶褍骞嬪Δ鐘靛仜濞差厼顕i崼鏇炵閹艰揪绱曢妶璺衡攽閿涘嫬浜奸柛濠冪墵楠炴劙鎳¢妶鍥╃厯闂佺懓顕崑鐔笺€呴弻銉︾厽闁逛即娼ф晶顖炴煕濞嗗繒绠插ǎ鍥э躬椤㈡稑饪伴崘銊ょ帛濠电偛鐡ㄧ划鎾剁不閺嶎厼绠栨俊銈傚亾妞ゎ偅绻堥幃娆擃敆閳ь剟顢旈敓锟� | 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柟闂寸绾惧綊鏌熼梻瀵割槮缁炬儳缍婇弻鐔兼⒒鐎靛壊妲紒鐐劤缂嶅﹪寮婚悢鍏尖拻閻庨潧澹婂Σ顔剧磼閹冣挃闁硅櫕鎹囬垾鏃堝礃椤忎礁浜鹃柨婵嗙凹缁ㄥジ鏌熼惂鍝ョМ闁哄矉缍侀、姗€鎮欓幖顓燁棧闂備線娼уΛ娆戞暜閹烘缍栨繝闈涱儐閺呮煡鏌涘☉鍗炲妞ゃ儲鑹鹃埞鎴炲箠闁稿﹥顨嗛幈銊╂倻閽樺锛涢梺缁樺姉閸庛倝宕戠€n喗鐓熸俊顖濆吹濠€浠嬫煃瑜滈崗娑氭濮橆剦鍤曢柟缁㈠枛椤懘鏌嶉埡浣告殲闁绘繃娲熷缁樻媴閽樺-鎾绘煥濮橆厹浜滈柨鏃囶嚙閺嬨倗绱掓潏銊︻棃鐎殿喗鎸抽幃銏ゆ惞閸︻厽顫岄梻鍌欑劍閻綊宕归挊澶呯細鐟滃秹鎮洪銏♀拻濞达絿鎳撻婊勭箾閹绘帞绠荤€规洘鍔曢埞鎴犫偓锝庝簽閻f椽鎮峰⿰鍕叆闁伙絿鍏樺畷锟犳倷閳哄倻鈧妫呴銏$カ缂佹煡绠栬棢闁跨喓濮甸埛鎴︽煠婵劕鈧洖鐡繝鐢靛仩椤曟粍淇婇崶鈺佸灊濠电姴娲ょ粻缁樸亜閺冨洤浜归柛婵囶殕缁绘稓鈧數枪瀛濆銈嗗灥濡繈骞冮敓鐘冲亜闂傗偓閹邦喚鐣炬俊鐐€栭悧妤冨枈瀹ュ绠氶柛顐犲灮绾惧ジ鏌e▎鎰噧婵炶绠撻幃鈥斥枎閹惧鍘遍棅顐㈡处濞叉牜鏁捄琛℃斀妞ゆ棁鍋愭晶娑氱磼缂佹ḿ娲撮柟铏箞閺屽洭鏁冮埀顒€鈻撻銏♀拺閻庡湱濯ḿ鎰版煕閵娿儳绉洪柛鈹惧亾濡炪倖甯掗敃锔剧矓閻㈠憡鐓曢悗锛卞啩澹曢梻鍌欑缂嶅﹪寮ㄩ崡鐑嗘富濞寸姴顑呴拑鐔兼煥濠靛棭妲归柛瀣姍閺屾稖绠涢幘鏉戞畬闂佺硶鏅涢幊妯侯潖濞差亜宸濆┑鐘插暟閸欏棝姊洪崗鍏笺仧闁搞劌鐖煎畷娲閻欌偓閸氬顭跨捄鐚村姛闁汇倐鍋撻梻鍌欒兌缁垶銆冮崨瀛樺亱闊洦绋戦崒銊╂煟閵忕姵鍟為柍閿嬪灴閺屾稑鈽夊鍫濅紣闂佽绻掗崰鏍蓟濞戞瑧绡€闁告劦浜滈埛鍫ユ⒑闁偛鑻晶顖炴煟閺冩垵澧存鐐茬箻閺佹捇鏁撻敓锟� | 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柟闂寸绾惧綊鏌熼梻瀵割槮缁炬儳缍婇弻鐔兼⒒鐎靛壊妲紒鐐劤濠€閬嶅焵椤掑倹鍤€閻庢凹鍙冨畷宕囧鐎c劋姹楅梺鍦劋閸ㄥ綊宕愰悙鐑樺仭婵犲﹤鍟扮粻鑽も偓娈垮枟婵炲﹪寮崘顔肩<婵炴垶鑹鹃獮鍫熶繆閻愵亜鈧倝宕㈡禒瀣瀭闁割煈鍋嗛々鍙夌節闂堟侗鍎愰柣鎾存礃缁绘盯宕卞Δ鍐唺缂備胶濮撮…鐑藉蓟閳ュ磭鏆嗛柍褜鍓熷畷浼村箻閼告娼熼梺鍦劋椤ㄥ懘锝為崨瀛樼厽婵☆垵娅i敍宥吤瑰⿰搴濈敖缂佽鲸鎹囧畷鎺戔枎閹烘垵甯┑鐘愁問閸o絿绮婚弽顓熸櫜闁绘劖娼欑欢鐐烘煙闁箑鍔﹂柨鏇炲€归悡鏇㈡煛閸ャ儱濡奸柣蹇曞Х缁辨帡鎮╁畷鍥ㄥ垱闂佸搫鏈惄顖炪€侀弴銏℃櫜闁糕剝鐟Σ鐗堜繆閻愵亜鈧洘顨ラ崫銉х煋闁荤喖鍋婂ḿ鏍煣韫囨挻璐¢柣顓熺懄缁绘盯宕卞Ο鍝勫Б闂佸憡鎸鹃崑鎾舵崲濞戞埃鍋撳☉娆嬬細闁活厹鍊曢湁婵犲﹤绨肩花缁樸亜閺囶亞鎮奸柟椋庡Т闇夐悗锝庡亽濞兼棃姊绘笟鈧ḿ褏鎹㈤幒鎾村弿闁割偁鍎辨儫闂佹寧妫佸銊ц姳婵犳碍鈷戦柛婵嗗閳ь剚鎮傞幃妯衡攽閸垻顦梺鍝勭Р閸斿秹宕h箛娑欏仭婵炲棗绻愰瀛樼箾閸喓鐭掗柡宀€鍠栭、娆撴偂鎼粹懣鈺佄斿Δ濠佺胺闁告鍟块悾鐑藉Ω閳哄﹥鏅i悷婊冮琚欏鑸靛姈閳锋垶鎱ㄩ悷鐗堟悙闁绘帗妞介弻娑㈠Ω閳衡偓閹查箖鏌曢崱妤€鏆炵紒缁樼箞瀹曟帡濡堕崨顕呭悪闂傚倷绀侀幖顐ゆ偖椤愶箑纾块弶鍫氭櫇娑撳秹鏌i悢绋挎珵鐟滅増甯楅弲鏌ユ煕濞戝崬鏋︾痪顓涘亾闂傚倷绀侀幉锟犳偡閵夈儙娑樷攽閸♀晜缍庨梺鎯х箰濠€杈╁閸忛棿绻嗘い鏍ㄧ箓閸氳銇勯敂鍝勫姦婵﹨娅g划娆撳礌閳ュ厖绱f繝鐢靛Л閸嬫捇姊洪鈧粔鎾倿閸偁浜滈柟鍝勭Х閸忓矂鏌涢悢鍝ュ弨闁哄瞼鍠栧畷娆撳Χ閸℃浼� |
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