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基因克隆是分子生物学中的一种基本的操作方法。通过双酶切来构建载体是其中常用的一种方法,这种方法利用限制性内切酶可以识别并切割特定的核苷酸的原理,用两种不同的限制性内切酶切割靶基因得到前后都带有粘性末端的靶基因片段,与同样经两种限制性内切酶切割得到的带有相同粘性末端的线性载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接,从而实现基因克隆。但是在实际操作中经常会遇到酶切效率及连接效率不高等问题,致使靶基因片段插入载体相当困难,为此人们采取了多种策略进行克隆。最近开发了一种叫做同源重组的基因克隆方法, 相比双酶切载体构建方法,该方法的构建过程有些不同。首先,靶基因片段扩增引物有别于常规引物设计;其次,载体切割过程中只需要进行单酶切;第三,载体和目的基因片段的连接是基于同源重组而不是粘性末端互补。
载体构建是分子生物研究常用的手段之一,整个过程包括目的基因扩增,载体和目的基因酶切,末端间连接,感受态细胞转化和阳性克隆的筛选,每一个步骤都必须严格控制其反应条件。
一、双酶切构建载体方法
双酶切构建载体方法比较繁琐。
首先,对引物的设计有着严格的要求,引物的长度一般为18-25bp,GC含量控制在40%-60%,上、下游引物之间GC含量不能相差太大,引物中需要加入酶切位点及保护性碱基。引物设计不当可能在扩增时生成引物二聚体,给实验带来不便。
其次,目的基因有必要进行TA克隆。在后续的实验操作中,可能会由于酶切效率和连接效率低等原因使得载体构建相当困难,目的基因扩增在这些步骤之前,由于PCR扩增是体外扩增,很容易发生突变,TA克隆有着成功率高的优点,通过TA克隆将目的基因构建进pMD 19T进而转化入大肠杆菌中,单克隆菌体自身的修复机制可保证单一的克隆,利于筛选需要的序列,通过后续测序鉴定可以得到大量正确的目的基因片段,而且直接将PCR产物切下来不易产生粘性末端,连接入表达载体比较困难,通过TA克隆酶切的目的片段产生粘性末端的概率很高。
第三,双酶切效率不高。由于不同的酶所对应的缓冲液不同,内切酶只有在最适的缓冲液环境下效率才能得到最优化,但是双酶切体系势必使其中一个酶的活性有所损失。这样必定会使酶切产物不纯。酶切产物中既有单酶切线性载体,也有双酶切线性载体,使得连接时所需要的双酶切线性载体的量失准,影响连接效率。因此可以先用一个限制性内切酶切割纯化回收,但工作量较大,回收率低。
第四,连接效率低。pMIR reporter与目的片段的摩尔比很重要,一般在3:1-10:1间浮动,而且连接效率和连接反应体积也有关系。
二、同源重组法构建载体
采用同源重组法构建载体与常规双酶切构建载体方法不同。
首先,设计引物时上游引物5’端前面加的是酶切位点(如Hind III)及该酶切位点在pMIR reporter载体中对应前面的15个碱基载体片段,下游引物5’端前面加的是Hind III酶切位点及该酶切位点在pMIR reporter载体中对应后面的15个碱基载体片段,如此设计引物是为了保证目的片段插入载体时方向正确。
其次,载体只需要单酶切,用Hind III酶切pMIR reporter,使得pMIR reporter成为两端都带着Hind III位点的线性载体。相比双酶切切割载体,单酶切可以保证酶切后的载体都是单一的线性片段,使得后续的重组连接更准确。
第三,省去了TA克隆环节。因为PCR产物可以直接用于重组连接,不需要酶切产生粘性末端,而且重组酶的重组能力强于T4 DNA连接酶的连接能力,一般只需要一步即可重组连接成功,因此可以在重组反应之后进行测序鉴定。
总之,两种方法各有利弊,双酶切构建过程比较繁琐,同源重组构建过程相对简单,可以省去很多的时间和精力,但假阳性率略高。
文章来源:每日生物评论。https://www.sohu.com/a/273376099_596172
1/1 | 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柟闂寸绾惧綊鏌熼梻瀵割槮缁炬儳缍婇弻鐔兼⒒鐎靛壊妲紒鐐劤缂嶅﹪寮婚悢鍏尖拻閻庨潧澹婂Σ顔剧磼閻愵剙鍔ゆ繝鈧柆宥呯劦妞ゆ帒鍊归崵鈧柣搴㈠嚬閸欏啫鐣峰畷鍥ь棜閻庯絻鍔嬪Ч妤呮⒑閸︻厼鍔嬮柛銊ョ秺瀹曟劙鎮欏顔藉瘜闂侀潧鐗嗗Λ妤冪箔閹烘挶浜滈柨鏂跨仢瀹撳棛鈧鍠楅悡锟犮€侀弮鍫濋唶闁绘柨寮剁€氬ジ姊绘担鍛婂暈缂佽鍊婚埀顒佸嚬閸o綁宕洪姀鈥崇窞闁归偊鍘鹃崢鍗炩攽閳藉棗鐏犻柣蹇旂箖缁傚秹宕烽鐘碉紲濡炪倖妫侀崑鎰櫠閿旈敮鍋撶憴鍕闁靛牊鎮傞獮鍐閵忋垻鐓撻梺鍓茬厛閸犳洜妲愰悢灏佹斀闁绘ɑ鍓氶崯蹇涙煕閻樻剚娈滈柕鍡楀暣瀹曘劑顢橀崶銊р槈閾绘牠鏌涘☉鍗炲箻妞わ富鍣e娲箰鎼淬垻顦ラ梺绋匡工缂嶅﹪骞冮敓鐘参ㄩ柨鏂垮⒔閻﹀牓姊婚崒姘卞缂佸甯¢弫宥咁吋閸℃洜绠氶梺鍦帛鐢骞夐崫銉х<閺夊牄鍔屽ù顕€鏌熼瑙勬珚闁诡喗绮岃灒闁绘挸瀛╅柨顓熺節閻㈤潧鍓崇紒鑼舵鐓ら柕鍫濐槹閺呮繃銇勮箛鎾村櫢缂佽妫濋弻娑㈩敃閿濆棛顦ュ┑锛勫仒缁瑩寮诲☉銏犵疀闁靛⿵闄勯悵鏇㈡⒑閸濆嫭顥欓柛妤€鍟块~蹇曠磼濡顎撻梺鍛婄☉閿曘儵宕曢幘缁樷拺鐟滅増甯楅弫閬嶆煕閵娿儲璐℃俊鍙夊姍閹瑧鈧稒锚椤庢捇姊洪崨濠冨碍鐎殿喖澧庣槐鐐存償閵婏腹鎷洪梺璇″瀻閸涱垼鍟堟俊鐐€ら崑鍕囬鐐村仼闂佸灝顑呯欢鐐烘煙闁箑骞橀柛姗嗕簼缁绘繈鎮介棃娑楃捕闂佽绻戠换鍫濈暦濠靛棌鍫柛顐ゅ枔閸樿棄鈹戦悩缁樻锭閻庢凹鍓熼幃姗€宕f径瀣伎婵犵數濮撮崯顖炲Φ濠靛鐓欐い鏃€鍎抽崢瀵糕偓娈垮枛閻栧ジ鐛幇顓熷劅妞ゆ柨鍚嬮弳蹇涙⒒閸屾艾鈧兘鎳楅崼鏇炵疇闁规崘顕ч崥褰掓煛瀹ュ骸骞栫紒鐙€鍨堕弻銊╂偆閸屾稑顏�:7 | 婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柛娑橈攻閸欏繘鏌i幋锝嗩棄闁哄绶氶弻娑樷槈濮楀牊鏁鹃梺鍛婄懃缁绘﹢寮婚敐澶婄婵犲灚鍔栫紞妤呮⒑闁偛鑻晶顕€鏌涙繝鍌涘仴妤犵偞鍔栫换婵嬪礃椤忓棗楠勯梻浣稿暱閹碱偊顢栭崶鈺冪煋妞ゆ棃鏁崑鎾舵喆閸曨剛锛橀梺鍛婃⒐閸ㄧ敻顢氶敐澶婇唶闁哄洨鍋熼娲⒑缂佹ḿ鎳冮柟铏姍閻涱噣濮€閵堝棌鎷婚梺绋挎湰閻燂妇绮婇悧鍫涗簻妞ゆ劑鍩勫Σ鎼佹煟閿濆懎妲婚摶锝夋偠濞戞帒澧查柣蹇撳暙閳规垿鎮欓弶鎴犱桓缂佺偓婢樼粔褰掋€侀弴鐔侯浄閻庯綆鍋嗛崢顏堟⒑閸撴彃浜濈紒璇插暣瀹曨垶骞掑Δ浣哄幐闂佸憡鍔戦崝搴㈡櫠濞戙垺鐓涢柛娑卞枤閸欌偓闂佸搫鏈粙鎴﹀煡婢舵劕纭€闁绘劘灏欓鎴炵節閻㈤潧浠滈柣妤€锕幃锟犲灳閹颁焦缍庨梺鎯х箰濠€閬嶆儗濞嗘劗绠鹃柛鈩兠崝銈夋煕閹惧瓨绶叉い顏勫暣婵″爼宕卞Δ鍐ф樊婵$偑鍊х粻鎾翅缚瑜旈、姘舵晲閸℃瑧鐦堝┑顔斤供閸樿棄鈻嶅⿰鍫熲拺闁告稑锕﹂埥澶愭煕婵犲偆鐓肩€规洜澧楅幆鏃堝Ω閵壯冨箳闂佺懓鍚嬮悾顏堝礉瀹€鈧划璇差潩鏉堛劌鏋戦柟鍏兼儗閻撳牓寮繝鍥ㄧ厱闁哄洢鍔岄悘锟犳煟閹惧鈽夋い顓℃硶閹瑰嫰鎮滃鍡橈紒婵犵數鍋涢幊搴∥涘☉姘潟闁圭儤姊圭€氭岸鏌ょ喊鍗炲妞わ絽鎼—鍐Χ鎼粹€茬盎缂備胶绮敃銏ょ嵁閺嶎厼鎹舵い鎾跺枎閺嬪倿姊洪崨濠冨闁稿妫濋弫宥堢疀濞戞瑢鎷绘繛鎾村焹閸嬫挻绻涙担鍐插娴犳岸姊绘担鍛靛湱鈧稈鏅犻幃锟犳晸閻樿尙鐣洪梺姹囧灮鏋い顐㈡嚇閺屾洟宕煎┑鍥舵闂佸綊鏀卞钘夘潖濞差亝鍤掗柕鍫濇噺閻庢儳鈹戦悩顔肩仾闁挎岸鏌嶇紒妯诲磳闁糕晪绻濆畷銊╊敊閹冪闂傚倷绀侀幉锟犲垂椤栫偛纾归柡宥庡亐閸嬫挸顫濋悙顒€顏� | 婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柛娑橈攻閸欏繘鏌i幋锝嗩棄闁哄绶氶弻娑樷槈濮楀牊鏁鹃梺鍛婄懃缁绘﹢寮婚敐澶婄闁挎繂妫Λ鍕⒑閸濆嫷鍎庣紒鑸靛哺瀵鎮㈤崗灏栨嫽闁诲酣娼ф竟濠偽i鍓х<闁绘劦鍓欓崝銈嗐亜椤撶姴鍘寸€殿喖顭烽弫鎰緞婵犲嫮鏉告俊鐐€栫敮濠囨倿閿曞倸纾块柟鍓х帛閳锋垿鏌熼懖鈺佷粶濠碘€炽偢閺屾稒绻濋崒娑樹淮閻庢鍠涢褔鍩ユ径鎰潊闁冲搫鍊瑰▍鍥⒒娴g懓顕滅紒璇插€歌灋婵炴垟鎳為崶顒€唯鐟滃繒澹曢挊澹濆綊鏁愰崨顔藉創閻忓繐绻樺娲川婵犲孩鐣锋繝鐢靛仜閿曘倝顢氶敐鍡欑瘈婵﹩鍘兼禍婊堟⒑缁嬭法绠伴柣銊у厴楠炲繑绻濆顓犲幗闁硅壈鎻徊楣冨汲閳哄懎鍑犳い蹇撳閺€浠嬫煃閵夈劌鐨洪柣顓熺懄閹便劍绻濋崘鈹夸虎閻庤娲﹂崑濠傜暦閻旂⒈鏁嗛柍褜鍓欓埢宥夊Χ閸モ晝锛濇繛杈剧悼閻℃棃宕靛▎鎾寸厽婵°倓鐒︾亸顓熴亜閺囶亞绋荤紒缁樼箓椤繈顢栭埞鐐珚闁哄本娲樺鍕醇濠靛牅鐥梻浣告惈閸婄敻宕戦幘缁樷拻闁稿本鐟ㄩ崗宀€鐥鐐靛煟鐎规洘绮岄埞鎴犫偓锝庡亝濞呮梻绱撻崒姘偓鐑芥倿閿曞倸绀夐柡宥庡幗閸庡孩銇勯弽銊ュ毈婵炲吋鐗楃换娑橆啅椤旇崵鐩庨悗鐟版啞缁诲倿鍩為幋锔藉亹闁圭粯甯╅崝澶愭⒑娴兼瑧鎮奸柛蹇旓耿楠炲啫螖閸涱厾顦ф繝銏f硾閿曪絾绔熼弴銏♀拻濞达絽鎽滅粔鐑樹繆椤愩儲纭剁紒顔肩墛閹峰懘鎼归柅娑氱憹闂備礁鎼粔鏌ュ礉鐎n剚宕查柛鈩冪⊕閻撳繘鏌涢锝囩畵闁逞屽墮閹诧紕绮嬪鍡愬亝闁告劏鏂侀幏娲煟鎼粹剝璐″┑顔炬暬钘熷璺侯儍娴滄粓鏌ㄩ弮鍥跺殭闁诲骏绠撻弻娑㈠煘閸喚浠煎銈嗘尭閵堢ǹ鐣烽崡鐐嶇喖鎳栭埞顑惧€濆缁樼瑹閳ь剙岣胯閸e綊姊洪崨濠佺繁闁搞劍澹嗛弫顕€骞掗弮鍌滐紳闂佺ǹ鏈懝楣冨焵椤掑嫷妫戠紒顔肩墛缁楃喖鍩€椤掆偓閻g兘骞囬弶澶哥炊闂侀潧锛忛崨顖氬脯闂傚倷绀佸﹢閬嶆惞鎼淬劌绐楅柟鎹愵嚙绾惧鏌熺€涙ḿ璐╃憸鐗堝笒缁€鍌炴煕韫囨艾浜圭紒瀣喘濮婄粯鎷呯粙鑳煘濠电偛妯婇崣鍐嚕婵犳碍鏅插璺猴攻椤ユ繈姊洪崷顓€鍦偓娑掓櫊瀹曟洟骞樼紒妯衡偓鍨箾閸繄浠㈤柡瀣枎閳规垿鎮欑拠褍浼愬銈庡亜缁绘帞妲愰幒鎳崇喓鎷犲顔瑰亾閹剧粯鈷戦柟顖嗗懐顔婇梺纭呮珪閹稿墽鍒掗銏犵伋闁哄倶鍎查弬鈧梻浣虹帛閸旀牞銇愰崘顏嗘/鐟滄棃寮婚敐鍛傛棃宕橀妸鎰╁灲閺岋綁鏁愰崶褍骞嬪Δ鐘靛仜濞差厼顕i崼鏇炵閹艰揪绱曢妶璺衡攽閿涘嫬浜奸柛濠冪墵楠炴劙鎳¢妶鍥╃厯闂佺懓顕崑鐔笺€呴弻銉︾厽闁逛即娼ф晶顖炴煕濞嗗繒绠插ǎ鍥э躬椤㈡稑饪伴崘銊ょ帛濠电偛鐡ㄧ划鎾剁不閺嶎厼绠栨俊銈傚亾妞ゎ偅绻堥幃娆擃敆閳ь剟顢旈敓锟� | 婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柛娑橈攻閸欏繘鏌i幋锝嗩棄闁哄绶氶弻娑樷槈濮楀牊鏁鹃梺鍛婄懃缁绘﹢寮婚敐澶婄闁挎繂妫Λ鍕⒑閸濆嫷鍎庣紒鑸靛哺瀵鎮㈤崗灏栨嫽闁诲酣娼ф竟濠偽i鍓х<闁绘劦鍓欓崝銈嗐亜椤撶姴鍘寸€殿喖顭烽弫鎰緞婵犲嫮鏉告俊鐐€栫敮濠囨倿閿曞倸纾块柟鍓х帛閳锋垿鏌熼懖鈺佷粶濠碘€炽偢閺屾稒绻濋崒娑樹淮閻庢鍠涢褔鍩ユ径鎰潊闁冲搫鍊瑰▍鍥⒒娴g懓顕滅紒璇插€歌灋婵炴垟鎳為崶顒€唯鐟滃繒澹曢挊澹濆綊鏁愰崨顔藉創閻忓繐绻樺娲川婵犲孩鐣锋繝鐢靛仜閿曘倝顢氶敐鍡欑瘈婵﹩鍘兼禍婊堟⒑缁嬭法绠伴柣銊у厴楠炲繑绻濆顓犲幗闁硅壈鎻槐鏇熺濞戙垺鐓熼柍鈺佸暞缁€鍫㈢磼椤曞棛鍒伴摶鏍煕濞戝崬鏋撻柟閿嬫そ閺屸剝寰勭仦鎴掓勃婵犮垻鎳撳Λ婵婃闂佹寧娲栭崐褰掑磹閸偅鍙忔慨妤€妫楁禍婊呪偓瑙勬尭濡盯鍩€椤掍緡鍟忛柛鐘崇洴椤㈡俺顦归柛鈹垮劜瀵板嫰骞囬澶嬬秱闂備胶绮摫鐟滄澘鍟扮划濠囶敋閳ь剙顫忕紒妯肩懝闁逞屽墮宀h儻顦抽柣蹇旂懇濮婅櫣绮欓幐搴℃敪婵炲瓨绮犻崜娑㈠礆閹烘梻纾兼俊顖濆亹閻﹀牆鈹戦鏂や緵闁告ɑ鎮傞獮蹇撁洪鍛嫼闂佸憡绋戦敃锕傚煡婢跺娈版い蹇撴噺缂嶆垿鏌嶇紒妯诲磳鐎殿喗鎸抽幃鈺咁敃椤厼顥氶梻浣呵圭换鎰八囬娑氼洸濡わ絽鍟埛鎴犳喐閻楀牆绗氶柨娑氬枔缁辨帡鍩€椤掍焦濯撮柧蹇涒偓娑氱憹闂備礁鎼粔鏌ュ礉鐎n剚宕查柛鈩冪⊕閻撳繘鏌涢锝囩畵闁逞屽墮閹诧紕绮嬪鍡愬亝闁告劏鏂侀幏娲煟鎼粹剝璐″┑顔炬暬钘熷璺侯儍娴滄粓鏌ㄩ弮鍥跺殭闁诲骏绠撻弻娑㈠煘閸喚浠煎銈嗘尭閵堢ǹ鐣烽崡鐐嶇喖鎳栭埞顑惧€濆缁樼瑹閳ь剙岣胯閸e綊姊洪崨濠佺繁闁搞劍澹嗛弫顕€骞掗弮鍌滐紳闂佺ǹ鏈懝楣冨焵椤掑嫷妫戠紒顔肩墛缁楃喖鍩€椤掆偓閻g兘骞囬弶澶哥炊闂侀潧锛忛崨顖氬脯闂傚倷绀佸﹢閬嶆惞鎼淬劌绐楅柟鎹愵嚙绾惧鏌熺€涙ḿ璐╃憸鐗堝笒缁€鍌炴煕韫囨艾浜圭紒瀣喘濮婄粯鎷呯粙鑳煘濠电偛妯婇崣鍐嚕婵犳碍鏅插璺猴攻椤ユ繈姊洪崷顓€鍦偓娑掓櫊瀹曟洟骞樼紒妯衡偓鍨箾閸繄浠㈤柡瀣枎閳规垿鎮欑拠褍浼愬銈庡亜缁绘帞妲愰幒鎳崇喓鎷犲顔瑰亾閹剧粯鈷戦柟顖嗗懐顔婇梺纭呮珪閹稿墽鍒掗銏犵伋闁哄倶鍎查弬鈧梻浣虹帛閸旀牞銇愰崘顏嗘/鐟滄棃寮婚敐鍛傛棃宕橀妸鎰╁灲閺岋綁鏁愰崶褍骞嬪Δ鐘靛仜濞差厼顕i崼鏇炵閹艰揪绱曢妶璺衡攽閿涘嫬浜奸柛濠冪墵楠炴劙鎳¢妶鍥╃厯闂佺懓顕崑鐔笺€呴弻銉︾厽闁逛即娼ф晶顖炴煕濞嗗繒绠插ǎ鍥э躬椤㈡稑饪伴崘銊ょ帛濠电偛鐡ㄧ划鎾剁不閺嶎厼绠栨俊銈傚亾妞ゎ偅绻堥幃娆擃敆閳ь剟顢旈敓锟� | 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柟闂寸绾惧綊鏌熼梻瀵割槮缁炬儳缍婇弻鐔兼⒒鐎靛壊妲紒鐐劤缂嶅﹪寮婚悢鍏尖拻閻庨潧澹婂Σ顔剧磼閹冣挃闁硅櫕鎹囬垾鏃堝礃椤忎礁浜鹃柨婵嗙凹缁ㄥジ鏌熼惂鍝ョМ闁哄矉缍侀、姗€鎮欓幖顓燁棧闂備線娼уΛ娆戞暜閹烘缍栨繝闈涱儐閺呮煡鏌涘☉鍗炲妞ゃ儲鑹鹃埞鎴炲箠闁稿﹥顨嗛幈銊╂倻閽樺锛涢梺缁樺姉閸庛倝宕戠€n喗鐓熸俊顖濆吹濠€浠嬫煃瑜滈崗娑氭濮橆剦鍤曢柟缁㈠枛椤懘鏌嶉埡浣告殲闁绘繃娲熷缁樻媴閽樺-鎾绘煥濮橆厹浜滈柨鏃囶嚙閺嬨倗绱掓潏銊︻棃鐎殿喗鎸抽幃銏ゆ惞閸︻厽顫岄梻鍌欑劍閻綊宕归挊澶呯細鐟滃秹鎮洪銏♀拻濞达絿鎳撻婊勭箾閹绘帞绠荤€规洘鍔曢埞鎴犫偓锝庝簽閻f椽鎮峰⿰鍕叆闁伙絿鍏樺畷锟犳倷閳哄倻鈧妫呴銏$カ缂佹煡绠栬棢闁跨喓濮甸埛鎴︽煠婵劕鈧洖鐡繝鐢靛仩椤曟粍淇婇崶鈺佸灊濠电姴娲ょ粻缁樸亜閺冨洤浜归柛婵囶殕缁绘稓鈧數枪瀛濆銈嗗灥濡繈骞冮敓鐘冲亜闂傗偓閹邦喚鐣炬俊鐐€栭悧妤冨枈瀹ュ绠氶柛顐犲灮绾惧ジ鏌e▎鎰噧婵炶绠撻幃鈥斥枎閹惧鍘遍棅顐㈡处濞叉牜鏁捄琛℃斀妞ゆ棁鍋愭晶娑氱磼缂佹ḿ娲撮柟铏箞閺屽洭鏁冮埀顒€鈻撻銏♀拺閻庡湱濯ḿ鎰版煕閵娿儳绉洪柛鈹惧亾濡炪倖甯掗敃锔剧矓閻㈠憡鐓曢悗锛卞啩澹曢梻鍌欑缂嶅﹪寮ㄩ崡鐑嗘富濞寸姴顑呴拑鐔兼煥濠靛棭妲归柛瀣姍閺屾稖绠涢幘鏉戞畬闂佺硶鏅涢幊妯侯潖濞差亜宸濆┑鐘插暟閸欏棝姊洪崗鍏笺仧闁搞劌鐖煎畷娲閻欌偓閸氬顭跨捄鐚村姛闁汇倐鍋撻梻鍌欒兌缁垶銆冮崨瀛樺亱闊洦绋戦崒銊╂煟閵忕姵鍟為柍閿嬪灴閺屾稑鈽夊鍫濅紣闂佽绻掗崰鏍蓟濞戞瑧绡€闁告劦浜滈埛鍫ユ⒑闁偛鑻晶顖炴煟閺冩垵澧存鐐茬箻閺佹捇鏁撻敓锟� | 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柟闂寸绾惧綊鏌熼梻瀵割槮缁炬儳缍婇弻鐔兼⒒鐎靛壊妲紒鐐劤濠€閬嶅焵椤掑倹鍤€閻庢凹鍙冨畷宕囧鐎c劋姹楅梺鍦劋閸ㄥ綊宕愰悙鐑樺仭婵犲﹤鍟扮粻鑽も偓娈垮枟婵炲﹪寮崘顔肩<婵炴垶鑹鹃獮鍫熶繆閻愵亜鈧倝宕㈡禒瀣瀭闁割煈鍋嗛々鍙夌節闂堟侗鍎愰柣鎾存礃缁绘盯宕卞Δ鍐唺缂備胶濮撮…鐑藉蓟閳ュ磭鏆嗛柍褜鍓熷畷浼村箻閼告娼熼梺鍦劋椤ㄥ懘锝為崨瀛樼厽婵☆垵娅i敍宥吤瑰⿰搴濈敖缂佽鲸鎹囧畷鎺戔枎閹烘垵甯┑鐘愁問閸o絿绮婚弽顓熸櫜闁绘劖娼欑欢鐐烘煙闁箑鍔﹂柨鏇炲€归悡鏇㈡煛閸ャ儱濡奸柣蹇曞Х缁辨帡鎮╁畷鍥ㄥ垱闂佸搫鏈惄顖炪€侀弴銏℃櫜闁糕剝鐟Σ鐗堜繆閻愵亜鈧洘顨ラ崫銉х煋闁荤喖鍋婂ḿ鏍煣韫囨挻璐¢柣顓熺懄缁绘盯宕卞Ο鍝勫Б闂佸憡鎸鹃崑鎾舵崲濞戞埃鍋撳☉娆嬬細闁活厹鍊曢湁婵犲﹤绨肩花缁樸亜閺囶亞鎮奸柟椋庡Т闇夐悗锝庡亽濞兼棃姊绘笟鈧ḿ褏鎹㈤幒鎾村弿闁割偁鍎辨儫闂佹寧妫佸銊ц姳婵犳碍鈷戦柛婵嗗閳ь剚鎮傞幃妯衡攽閸垻顦梺鍝勭Р閸斿秹宕h箛娑欏仭婵炲棗绻愰瀛樼箾閸喓鐭掗柡宀€鍠栭、娆撴偂鎼粹懣鈺佄斿Δ濠佺胺闁告鍟块悾鐑藉Ω閳哄﹥鏅i悷婊冮琚欏鑸靛姈閳锋垶鎱ㄩ悷鐗堟悙闁绘帗妞介弻娑㈠Ω閳衡偓閹查箖鏌曢崱妤€鏆炵紒缁樼箞瀹曟帡濡堕崨顕呭悪闂傚倷绀侀幖顐ゆ偖椤愶箑纾块弶鍫氭櫇娑撳秹鏌i悢绋挎珵鐟滅増甯楅弲鏌ユ煕濞戝崬鏋︾痪顓涘亾闂傚倷绀侀幉锟犳偡閵夈儙娑樷攽閸♀晜缍庨梺鎯х箰濠€杈╁閸忛棿绻嗘い鏍ㄧ箓閸氳銇勯敂鍝勫姦婵﹨娅g划娆撳礌閳ュ厖绱f繝鐢靛Л閸嬫捇姊洪鈧粔鎾倿閸偁浜滈柟鍝勭Х閸忓矂鏌涢悢鍝ュ弨闁哄瞼鍠栧畷娆撳Χ閸℃浼� |
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