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[转载]用于RNA质量控制标准化的RIN(RNA完整值)

已有 1159 次阅读 2020-5-13 22:39 |系统分类:科研笔记|文章来源:转载

    RIN,即RNA integrity number(RNA完整值),在测序报告中经常出现,用来衡量从样品中抽提的RNA的质量,测序公司一般推荐RIN要大于7;RIN<6,会建议重新送样;RIN在6-7之间,存在测序风险,对于转录组测序和全转录组测序,存在文库产量低或建库失败;测序数据随机性差,可能会有偏好性;有效数据留存率低、mapping率低、基因覆盖不均匀、rRNA残留率高等风险,而对于Small RNA测序,则存在无目的条带、目的条带弱或杂带多;有效数据留存率低,reads分布异常等风险。

下面这篇文章出自安捷伦公司的应用简报,对RIN概念的介绍比较详细,摘自https://wenku.baidu.com/view/90ab7b29370cba1aa8114431b90d6c85ed3a8887.html

http://www.bio-equip.com/showarticle.asp?ID=453106525,略有删改。


摘要

评估RNA完整性是获得有意义基因表达数据的第一个关键步骤。微阵列或 qRT-PCR实验能否成功主要取决于RNA是否完整。Agilent 2100生物分析仪系统和RNA试剂盒在协助研究者确定RNA质量方面发挥重要作用。Agilent 2100生物分析仪系统上生成的谱图包括浓度信息,允许直观检查RNA完整性,并生成核糖体比值。本应用简报描述的新算法软件可用于从生物分析仪电泳图分析RNA样品的完整性。

 

前言

确定RNA起始材料的完整性是基因表达分析中的一个关键步骤。Agilent 2100生物分析仪系统及相关的RNA 6000 Nano试剂盒和Pico试剂盒已成为RNA质量评估和定量的标准[1,2]。在精密加工的芯片上利用电泳分离RNA样品,并利用荧光检测。通过生物分析仪软件可显示图像如电泳图和凝胶图以及多种分析结果如样品浓度和核糖体比值。电泳图提供了RNA样品质量的直观评估结果。然而,依赖肉眼观察解释数据的方法本身存在缺陷。此前,研究者们已将核糖体比值作为特征值应用在生物分析仪软件中,用来表征凝胶分析中RNA 的完整性。然而,仅通过总RNA的核糖体比值去评估RNA的完整性通常不准确[3]。通过显示RNA片段大小分布的详细画面,Agilent 2100生物分析仪系统能够提供更好的RNA完整性评估结果。

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图 1 总RNA样品经过不同时间降解,并且在Agilent 2100生物分析仪系统上使用真核细胞总RNA Nano分析法分析所得的样品。随着降解推进,可以观察到向较短片段大小方向偏移。

 

RNA降解是一个渐进的过程。随着降解推进,18S/28S核糖体条带比减小,而两个核糖体峰和下位内标之间的基线信号增大(图1)。生物分析仪软件自动生成18S/28S核糖体亚基的比值。尽管核糖体比值在确定凝胶电泳中样品降解程度方面发挥重要作用,但经过Agilent 2100生物分析仪系统更详细的分析表明,该比值未充分描述样品的完整性。

 

为了将RNA完整性解释过程标准化,安捷伦科技有限公司推出一种新的RNA质量评估工具。应用RNA完整值(RIN)这一指标,从整体电泳图出发,以消除RNA质量控制中的个人解释。RIN数值范围为1-10,将真核生物总RNA质量分类,其中1代表降解最严重的情况,10代表最完整。通过这种方式,有助于解释电泳图,令样品之间的比较成为可能,并确保实验的重复性。

 

RIN工具的开发

RIN软件算法针对Agilent 2100生物分析仪系统中用真核生物总RNA Nano分析法采集的样品开发。输入数据包括来自三个哺乳动物物种(人类、小鼠和大鼠)的不同组织中约1300份总RNA样品,所有样品的完整程度各不相同。RNA样品的分类由应用专家手动进行,他们将每份总RNA样品分类至1-10的预定编号系统。图2展示了不同RIN类别的代表性电泳图(编号分别为10、6、3、2)。

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图2 用于调试RNA完整值(RIN)软件的样品电泳图。样品为完整样品(RIN 10)至降解样品(RIN 2)。

为开发RIN算法,采用了神经网络等自适应学习工具(工具由Quantiom Bioinformatics提供)。这些工具允许确定可以从电泳图提取的关键特征。这些特征值采用的是电泳图的组成部分如信号峰面积,强度,比值等。图3中列出电泳图的重要要素。他们包括不同的区域(前区、5S区、快速区、中区、前体区、后区)和峰(标准品、18S、28S)。

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图 3 详述提示RNA质量的各区域的电泳图。

 

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图6 在降解度不同的样品上检验RNA完整值。RIN软件算法能够将样品精确分类。

 

核糖体比值

图7显示了在三台不同仪器上分析的同一份人脑(Ambion, Inc.)总RNA样品,并且显示了仪器1和仪器3的代表性电泳图。将采用生物分析仪软件生成的核糖体比值与RIN值比较。对于36份样品,与RIN值相比,采用核糖体比值时变异程度较大。RIN值的变异系数为1.4%, 而核糖体比值的变异系数为5.1%。

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图7 在三台不同仪器上分析36份总RNA样品。将RIN与核糖体比值比较。RIN的CV值显著低于核糖体比值。

 

分析不同稀释度的样品时,获得了类似图像(图8)。将小鼠脑组织的样品稀释为以下三个浓度:25ng/μL,100ng/μL和500ng/μL。在测试的108份样品中,RIN值大幅度优于核糖体比值。RIN的变异系数为3%,而核糖体比值的变异系数则为22%。应当指出,低于25 ng/μL时,不能获得准确的RIN值。而大于50 ng/μL的样品浓度能够获得最佳结果。

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图8 检验不同稀释程度的同一份RNA样品时,RIN值显著优于核糖体比值。

 

RIN的应用

RIN是测量RNA完整性的一款强大的新工具。图9中的图示给出了RIN的最佳实际使用案例。作为第一步,应当验证RIN值(图9A)。这可以通过将RIN值与特定下游实验如微阵列分析或RT-PCR关联来进行。可以利用这个关联步骤在成功的下游实验和失败的实验间建立RIN 阈值。可以在现有生物分析仪数据集合(如可获得)上进行此步骤。该阈值可用于标准RNA 质量控制程序(图9B)。RIN高于阈值的所有样品通过QC检验,而丢弃RIN值低于阈值的样品。如果重要实验参数变更(例如,研究不同的生物、使用不同类型的微阵列、采用不同的探针集等),则应当重复验证RIN的关联步骤。截至目前,已采用真核生物总RNA Nano分析法检验RIN算法。

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图 9 A. 将RIN 值与下游实验(例如微阵列或RT-PCR)关联并确定获得有用基因表达结果的阈值。B. 在已经进行初始关联实验并已经设定数据阈值后,RIN 值可以用于丢弃在Agilent 2100 生物分析仪系统中未通过样品QC的样品(RIN值低于阈值)。

 

RIN的局限性

RIN旨在提供明确的RNA完整性评估结果。给出了样品完整性的衡量标准,它可用于直接比较运输前后的样品,或用于比较不同实验室间的样品。最重要的是,它可以用来确保基因表达实验的重复性(只要涉及样品提取步骤)。然而,在无前期验证工作的情况下,RIN不能预测基因表达数据的效能。例如,一份样品可能过度降解而无法进行全基因组微阵列实验,但可能产生良好的RT-PCR数据。为了有效利用RIN,必须进行必要的关联工作。

 

结论

我们已经设计出一款能够比核糖体比值更好评估RNA质量的软件算法。RIN工具是RNA完整性评估标准化的重要环节。研究者不再受困于总RNA的主观分类。通过进行关联实验,可创建阈值以确保实验的重复性。已经发现RIN工具基本上没有仪器变异性及浓度变异性, 因此有助于仪器间及实验室间样品的比较。

 

参考文献

1. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribo-green analysis, and UV spectrometry,安捷伦应用简报,出版号 5988-7650EN, 2002

2. A microfluidic system for high-speed reproducible DNA sizing and quantitation, Electrophoresis, 21(1), 128-34,2000

3. Advancing the quality control methodology to asses isolated total RNA and generated fragmented cRNA,安捷伦应用简报,出版号5988-9861EN, 2003

 

致谢

我们要特别感谢合作伙伴Ambion Inc.、德国基因组研究资源中心(RZPD)以及 Quantiom Bioinformatics。我们还要特别感谢对RIN算法进行内部测试并提供宝贵意见的所有研究人员。




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