【研究背景】

干旱高盐低温都会影响植物的渗透作用，从而对其生长和产量造成很大的威胁。SnRK2s家族蛋白在渗透调节中起到了关键的作用。在没有ABA时，PP2C蛋白磷酸酶抑制激酶SnRK2.2/3/6活性；ABA积累与受体（PYR1/PYL/RCAR)结合抑制PP2C活性，SnRK2.2/3/6激酶活性释放，磷酸化下游组分调控渗透压力反应。拟南芥SnRK2家族10个成员中有9个能被渗透胁迫迅速激活。但是渗透胁迫如何激活SnRK2s还有待研究。

【研究结果】

1.作者通过in-gel kinase assay发现两组新的蛋白激酶OKs(100-130kDa)，甘露醇处理后2.5min被激活5分钟达到最高，且这种激活不依赖于SnRK2s和ABA.

2.作者对野生型和SnRK2s十突进行甘露醇处理后进行磷酸化组学分析，结果显示在野生型和突变体中RAF家族蛋白激酶的磷酸化迅速增加，且B4-RAF亚组蛋白激酶的分子量（117-140kDa)与OK¹³⁰一致，B2,B3-RAF蛋白激酶分子量（75-112kDa)与OK¹⁰⁰一致。

3.作者利用CRISPR -Cas9技术构建了RAF基因家族成员的多突变体。利用in gel kinase assay对突变体磷酸化检测表明，OKs¹³⁰蛋白特异地调控了不依赖ABA的SnRK2（SnRK2.1/4/5/9/10）的激活，而OKs¹⁰⁰特异地调控了ABA依赖的SnRK2.2/3/6的激活。在线网站http://bar.utoronto.ca/efp2搜索RAFs表达的组织特异性，发现在干种子和花粉中高表达，并且在根中受到高渗高盐的诱导。亚细胞定位实验证明在细胞质或者细胞质点状分布。

Q：这种high-order mutant 的构建是如何快速实现的呢？

4.作者对突变体进行甘露醇，NaCl,PEG处理，检测其种子发芽率生长状态和离子渗透率等。结合以前的研究（渗透压激活SnRK2s并不依赖于ABA）得出结论：OKs渗透胁迫后激活与PP2C无关。

5.作者通过IP-MS，split-luc，体外磷酸化等实验证明RAF能直接与SnRK2相互作用并磷酸化SnRK2s.质谱分析磷酸化位点SnRK2.4（Ser158, Ser162, Ser166, Thr167, Thr170 and Ser180),SnRK2.6(Ser171 ,Ser175).其中S171和S175两个保守的磷酸化位点是渗透胁迫和ABA信号通路中SnRK2.6的激活所必须的。后来作者又利用体外磷酸化和In-gel等实验来检测RAF对SnRK2s活性影响，结果发现解除PP2C的抑制后SnRK2s几乎没有自激活活性，RAF蛋白激酶对于SnRK2s的磷酸化介导了渗透胁迫对SnRK2的激活。

6.作者猜想RAF蛋白激酶是否也参与ABA信号通路呢？通过一系列实验证实RAFs家族蛋白激酶对于ABA诱导的SnRK2的激活也是必需的。

【总结】

本篇文章讲述了蛋白激酶RAFs-SnRK2s的级联反应在早期渗透胁迫和ABA通路中起到了非常重要的作用，OK130/B4 Raf调控不依赖ABA的SnRK2（SnRK2.1/4/5/9/10）的激活，而OK100/B2&3 Raf特异地调控了ABA依赖的SnRK2.2/3/6的激活，该研究为深入了解植物感受和应答渗透胁迫的分子机制提供了线索。

【借鉴点】

1.磷酸化蛋白质组学的应用

2.多基因的敲除的方法  （参考文献：A multiplex CRISPR/Cas9 platform for fast and efficient editing of multiple genes in Arabidopsis）