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(200301)H202传感器是拟南芥中的一种LRR受体激酶

已有 923 次阅读 2020-3-2 10:21 |个人分类:文献阅读笔记|系统分类:科研笔记

H202传感器是拟南芥中的一种LRR受体激酶

 

标题Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase

 in Arabidopsis

期刊Nature19 January 2020

第一作者吴飞华(博士

通讯作者Zhen-Ming Pei

通讯地址杜克大学

DOI10.1038/s41586-020-2032-3

 

一.研究背景

动物植物面对各种非生物和生物胁迫NADPH氧化酶/超氧化物歧化酶/其他机制促进eH202的生物合成→调节应激反应和生长发育。

(减数分裂、花粉管的生长、根毛生长、根干细胞生态位维持和脱落等)

eH202通过水通道蛋白进入胞浆,氧化细胞质。其中几种由H202共价修饰的蛋白质作为H202感受器。虽然离子通道和受体已经确定,但在细胞表明上是否存在eH202感受器是未知的

eH202→胞浆Ca2+浓度增加→气孔关闭,猜测该通路参与eH202的感知和信号的传递,但分子机制未知

 

 

二.生物学意义

①识别HPCA1作为eH202的传感器对于理解植物细胞内Ca2+的氧化还原是如何响应各种内外界刺激是至关重要的。

②在细胞表面上发现eH202感受器的意义重大:将内外部应力或信号转换成eH202状态,从而触发统一优化的信号通路,避免全细胞的氧化还原。

③找到eH202感受器,可以为基因工程作物提供潜在的基因靶点,在生物或非生物逆境下增强抗逆性进和产量。

 

 

 

 

三.主要结论

基于Ca2+成像的前向基因筛查,在拟南芥中分离出了hpca突变体,证明HPCA1是一种富含亮氨酸的受体激酶,在胞外区域有两对多余的半胱氨酸残基,属于之前未注明的一个亚家族。HPCA1定位在质膜上,H2O2可以对其胞外的半胱氨酸残基进行共价修饰,使其活化,导致HPCA1胞内区域自磷酸化。在保卫细胞中,可以促进Ca2+通道的活跃,诱导气孔的关闭

 image.pngimage.png

 

四.主要结果

1. hpca突变体的筛选

基于Ca2+成像的前向基因筛查,检测到了hpca突变体(常见方法未果)。利用全基因组重测序法,绘制了hpca的图谱(传统的定位方法未果)。其中hpca1现象最明显,它可以影响eH2O2信号的整体感知和转导。

1在甲磺酸乙酯诱变产生发光蛋白的M2代种子中,筛选4mM H2O2[Ca2+]i

增加减弱的幼苗→分别检测两代,筛选出具有稳定表型的株系。

(2)hpca1/WThpca1H2O2[Ca2+]i增加减弱,但在形态或发育方面无差异。(图1ab

     hpca1/WThpca1Ca2+增加的高峰降低、对H2O2敏感度降低,但对山梨醇和NaCl敏感度一致。(图1c-h

(3)hpca1/osca1/moca1相邻种植,hpca1不同于其他突变体,在H2O2不同处理下具有不同的表型。(附图2a-h

 

2. hpca1保卫细胞中受损的eH2O2Ca2+信号传导

(1)hpca1保卫细胞中,H2O2下,信号减弱,气孔关闭减弱。(图2a-d

(2)WT保卫细胞原生质体中,H2O2下,Ca2+电流强。(图2e-g

(3)hpca1中,在ABA→气孔关闭中存在明显缺陷。(图2h

(4)hpca1WT失水更快。(补充数据2i

 

hpca1的保卫细胞中eH2O2Ca2+以及ABA信号通路中存在缺陷

hpca1中对eH2O2的感知存在缺陷

 

3. HPCA1编码一种LRR受体激酶

(1)5hpca家系进行全基因组重测序→3hpca家系在同一基因上发生SNP→该基因编码LRR-RK(图3a)。

(编码受体激酶的基因是植物中最大的基因家族之一,LRR-RK是陆地植物中最大的受体激酶家族。)

(2)HPCA1属于Ⅷ-1亚家族,有8个功能未知的成员,都含有两对半胱氨酸残基,命名为过氧化氢区域(HP)。

(3)HPCA1可以弥补hpca1的表型→HPCA1是目标基因。(图3bc

(4)分析HPCA1启动子驱动的结构的转基因幼苗HPCA1在子叶和保卫细胞中广泛表达,但在根尖较少。(图3de

(5)【烟草瞬时表达】HPCA1蛋白定位在肿胀的等离子体化细胞的表面周围。(图3f

{HPCA1eH2O2信号传导中的作用}

(6)hpca1中,eH2O2诱导下,MAPK3MAPK6eH2O2的下游信号)的磷酸化程度降低,且在互补系中恢复。(附图7b

{HPCA1是否特定于H2O2信号传导或还有其他LRR-RKs}

(7)(鞭毛肽flg22、延长因子EF-Tu延生肽elf18elf26都是MAMPs(微生物表面共有的结构),可以诱导Ca2+增加)

fls2efr(相应受体突变体)    Ca2+不增加

hpca1        flg22elf26诱导的Ca2+增加不影响

fls2bak1   WTeH2O2信号传导水平一致

ghr1        eH2O2诱导的Ca2+增加不受影响

 

 

在保卫细胞eH2O2信号通路中有多个LRR-RK受体,

其中HPCA1或许是GHR1的上游感受器

 

 

4. eH2O2激活HPCA1激酶

{证明HPCA1激酶活性的必要性}

(1)蛋白激酶抑制剂K252a抑制[Ca2+]i增加,减弱Ca2+电流,抑制气孔关闭。(图3hi

(2)HPCA1-YEP hpca1-2  随着H2O2处理浓度的增加,HPCA1磷酸化程度增加(图3j

{HPCA1CD域是否具有激酶活性或作为一个支架}

3HPCA1K695ECDHPCA1D773LCDHPCA1Q856*CD    ×

HPCA1CD                MBP可自磷酸化和磷酸化→蛋白迁移率改变

     HPCA1CD  +γ蛋白磷酸酯酶                                    ×

(图3gk

4HPCA1 hpca1-2                        

      HPCA1K695Ehpca1-2               ×

HPCA1D773Lhpca1-2               ×

HPCA1Q685*hpca1-2               ×              (图3l

(5)【质谱法】

H2O2Thr786, Thr789, Thr790, Ser606, Ser607 Ser942 磷酸化程度增加(其中Thr786, Thr789, Thr790在保守催化子域之间)

 

eH2O2激活HPCA1激酶活性,导致HPCA1自磷酸化,传递信号至下游

5. H2O2氧化HPCA1的胞外半胱氨酸残基

(半胱氨酸硫醇H202→硫酸+SO2=氧化剂信号→动态生物反应的分子开关)

{HPCA1HP上的半胱氨酸残基是否可被H2O2修饰}

Ca2+电流

WT

hpca1

IA-biotin

×

×

MTSEA-biotin

\无   √

H2O2处理

×

1

 

 

                                             (试剂处理后30min内没有形成电流) 

 

                                              (图4a-d

                                                

HPCA1的胞外Cys要形成二硫键,促进CA2+电流的形成

→胞外Cys或许是eH2O2的感受位点

{Cys残基对于eH2O2感应的必要性}

(3)hpca1-2                               ×

     HPCA1 hpca1-2                        

     HPCA1C421S/424Shpca1-2         ×

     HPCA1C434S/436Shpca1-2         ×

HPCA14C/Shpca1-2              ×    (图4ef

{胞外Cys残基是否处于还原状态,可被氧化}

(4)HPCA1-YFP  hpca1-2 中的Cysred含量比HPCA14C/S-YFP  hpca1-2 重的更大,Cysred含量随着H2O2的增高而减少(图4g

→这四种Cys残基在胞外以还原态形式存在,在体内被H2O2氧化

{确定胞外Cys被氧化}

(5)H2O2Cysox增加  (图4h-j

 

 

eH2O2共价修饰HPCA1胞外的Cys残基,作为eH2O2的感应机制,

激活HPCA1的激酶活性,打开Ca2+通道

 

五.主要方法

基于发光蛋白质Ca2+成像、对hpca的遗传筛选、光谱学、基于YC3.6Ca2+成像、气孔孔径和密度生物测定、保卫细胞电生理、全基因组重测序定位、系统进化分析、组织化学GUS活性分析、亚细胞定位、重组蛋白纯化及激酶测定、免疫印迹分析、质谱分析

六.讨论

①细胞外空间处于氧化状态,并且暴露在细胞外的蛋白质在向质膜的运输过程中被氧化,如何产生或维持HPCA1胞外Cysred以防止构成性激活传感器,以及eH2O2Cysox是如何再生和还原的分子机制尚待确定。

②除了GHR1,富含半胱氨酸的受体样激酶也在eH2O2的传感和信号传递中起作用。但是,它们在eH2O2 Ca2+信号中的作用尚未确定。

③包括HPCA1在内的受体激酶下游的 Ca2+通道的分子机制还未知。




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