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(200226)组氨酸激酶MHZ1/OsHK1与乙烯受体相互作用调节 水稻根系生长

已有 721 次阅读 2020-3-2 10:13 |个人分类:文献阅读笔记|系统分类:科研笔记

组氨酸激酶MHZ1/OsHK1与乙烯受体相互作用调节

水稻根系生

 

标题Histidine kinase MHZ1/OsHK1 interacts with ethylene receptors to regulate root growth in rice

期刊Nature Communication24 January 2020

第一作者赵赫(博士  段凯旋(博士) 、马彪(工作人员)

通讯作者张劲松 研究员、陈受宜 研究员、马彪(工作人员)

通讯地址:中科院遗传与发育生物研究所

DOI10.1038/s41467-020-14313-0

 

一.研究背景

1.拟南芥:三重反应;一条线性的乙烯信号传导途径:内质网(ER)膜结合乙烯受体、一个Ser/Thr激酶(CTR1)、一种中央内质网膜蛋白(EIN2)、转录因子(EIN3/EIL1)、ERF1

image.png 

The Model of Ethylene Signaling Pathway in Arabidopsis.

(Zhang et al., 2015)

2.水稻和拟南芥中的乙烯信号传导途径之间具有保守性和发散性

3.组氨酸激酶(HK)在响应激素以及环境刺激调节植物发育方面起着至关重要的作用。HK介导的多步磷酸转移涉及包含磷酸转移酶和接受域的混合型HK、含组氨酸的磷酸转移蛋白(HPt)和反应调节器(RR)。

4.乙烯受体和细菌的HK结构上相似,有些乙烯受体例如ETR1ERS1确实含有典型的HK活性。但是,乙烯受体的HK活性不是乙烯信号传导所必需的,只是在该通路中起调节作用。到目前为止,乙烯受体是如何传递信号的还很不清楚。

5.拟南芥中的HK5AHK5),是一种非乙烯受体HK,它是乙烯和ABA抑制根伸长的依赖ETR1信号通路中的负调节因子。相比之下,玉米同源基因ZmHK9在转基因拟南芥中对乙烯和ABA的根系生长响应中起着正调控作用。OsHK1,一种水稻组氨酸激酶,通过细胞分裂素相关途径在根系生长和环绕中发挥作用。然而,在这些研究中,对HKs调控信号级联反应的分子机制知之甚少。

 

二.生物学意义

水稻是重要的农作物,长期生活在水生环境中。乙烯在水稻适应这种半水生环境的过程中发挥重要作用。该文为水稻乙烯信号传导机制提供了有价值的见解,有助于改善作物的胁迫适应性和相关农艺性状。

 

三.主要结论

MHZ1编码一种水稻组氨酸激酶OsHK1,其正向调控水稻根中的乙烯反应。MHZ1是一种功能混合型的HK,能够在保守的组氨酸上自磷酸化,并将磷基通过其接收域转移到OsAHP1/2,然后进一步转移到响应调节器OsRR21上。MHZ1HK活性和它所介导的磷酸级联反应在水稻根中的乙烯反应中是不可或缺的。乙烯受体可以通过其GAF域余MHZ1蛋白结合,进而抑制其组氨酸活性。

当缺乏乙烯时,乙烯受体出于活跃状态,可以与MHZ1互作,其激酶活性被抑制。当存在乙烯时,乙烯受体解除对MHZ1的抑制作用,可以使MHZ1磷酸化,调控根系生长。这一途径可能是一个与OsEIN2介导的通路相平行的分支,两者都在乙烯受体信号的下游作用,以调节水稻的根系生长。image.png

 

四.主要结果

1.mhz1的特性及基因鉴定


①空气中:mhz1-1mhz1-2的胚芽鞘/芽和根在生长方面与WT相似

  乙烯中:WT根长大幅度减少;mhz1-1mhz1-2的根长没有被抑制→两个突变体初级根表现出对乙烯的不敏感性(图1a

mhz1-1mhz1-2的胚芽鞘生长对乙烯的反应正常,只是突变体的胚芽鞘比WT稍长。(图1a

mhz1-1的幼苗比WT长(附图1a

mhz1-3mhz1-4mhz1-1mhz1-2的现象相似(附图1b

                                       

在根系生长中,mhz1对乙烯不敏感

 

⑤【TALL-PCRMHZ1被确定在LOC_Os06g44410(位点名称?)

mhz1-1中将T-DNA插入从该基因的起始密码子开始的第五个内含子中的2032bp-2033bp之间(图1bc)→MHZ1不表达(图1d

(其余等位基因也被进一步分析)

⑥用WT基因组DNA片段进行遗传转化,弥补了mhz1-1的乙烯不敏感表型(附图1c

 

MHZ1对应于位点LOC_Os06g44410编码组氨酸激酶OsHK1

 

 

MHZ1/OsHK1编码一个含有936个氨基酸的组氨酸激酶(组氨酸区域365-655;接受域817-961)(图1c和附图2a

⑧【系统进化分析法】MHZ1不属于乙烯受体家族或细胞分裂素受体家族的同源物。MHZ1AHK5ZmHK9的同源物。(这些基因都在乙烯反应起作用中)(附图3

MHZ1与单子叶植物中的同源蛋白聚集在一起(附图2b),这些蛋白质的N端有盘绕和PAS结构域(附图2c)?

 

2.MHZ1过表达增强根中乙烯反应

WT中过表达MHZ1MHZ1-OE在空气中和乙烯中的根都更短→乙烯反应构成性表型(图1e)。

MHZ1-OE中乙烯产量没有提高→其短根表型不是由于乙烯排放的升高造成的(附图5

1-甲基环丙烯(1-MCP)(1-MCP乙烯产生和作用的抑制剂)处理后在很大程度上抑制了这些系的短根表型→MHZ1功能需要乙烯受体信号传导(图1e

④【qPCRmhz1中,OsRRA5, OsERF002 OsRAP2.8(之前确定的乙烯诱导基因)的乙烯诱导表达在很大程度上被阻断

         MHZ1-OE的根中,空气/乙烯,OsRRA5, OsERF002 OsRAP2.8的表达大大增强(图1f

MHZ1-OE的根中,空气/乙烯,OsRRA5OsRAP2.8 的表达没有增强,OsERF002的表达被促进(特别是乙烯存在时)(图1f)。

mhz1/MHZ1-OE的根和芽中,空气/乙烯,OsERF063 OsERF073不受影响(图1f)→有些基因的表达不依赖MHZ1

 

在分子水平上,mhz1MHZ1-OE对乙烯的反应不同,具有一定的器官和基因特异性

 

3. 乙烯诱导的MHZ1表达需要OsEIN2OsEIL1

model中未体现?)

MHZ1转录本在根中很丰富,但在胚芽鞘和其他器官中较少,并且是由根中的乙烯诱导的(图2a和附图4a

②【烟草瞬时测定系统】乙烯诱导MHZ1需要OsEIN2OsEIL1OsEIL1可以与MHZ1启动子中的ATGTA元件结合,激活启动子活性(图2a,b,c

③【Promoter-GUSMHZ1启动子的活性主要定位于节部、根维管束和根皮层的根起始位点。在茎、叶、谷壳和胚芽鞘中也观察到这种活性(附图4b

④乙烯处理一定程度上增强了MHZ1启动子的活性,特别是在根尖分生组织上方的区域(附图4c

 

 

 

 

4. MHZ1通过OsAHPs磷酸基团转移到OsR21

 

①产生不同的突变蛋白或截短版本,并测试其磷酸化能力(图3a)。→【磷酸化实验】GST-MHZ1Ca2+存在时表现出较强的激酶活性;当第375位保守的His突变为Gln时,该活性丧失(图3b)。

②在正常的GST-MHZ1下面有一个较小的放射带,可能是降解产物(图3b)。

③在生理水平ATP浓度下,GST-MHZ1Ca2+Mg2+存在下具有激酶活性(附图6a

                                    

MHZ1是一种功能性的HK

 

 

GST-KDMBP-KD(不含接受域,包含激酶结构域)仍具有自磷酸化活性(图3c)。

MBP-G1MBP-G2(激酶结构域中结合ATP的保守的G1G2突变)的激酶活性丧失(图3c)。然而,这两种突变蛋白可以被正常激酶结构域GST-KD磷酸化。

 

MHZ1的自磷酸化可以以反式方式发生?

 

 

⑤(水稻中有五种磷酸转移酶HPts (OsAHP1/2, OsPHP1/2/3) 和多种B型反应调节器RRsGST-MHZ1可以将磷酸基团转移给OsAHP1/2,而不能转移给OsPHP1/2→底物特异性(图3d);OsPHP3是一个分散的假基因,不能被检测。

OsAHP1OsAHP2分别在H79QH80Q突变,都通过GSTMHZ1破坏了它们的磷酸化→这些残基很可能是它们的磷酸基团接受位点。

⑦最初鉴定的能在大肠杆菌中表达的六种RROsRR21 to OsRR26),只有OsRR21 OsRR26成功表达,但只有OsRR21能够接收来自OsAHP1或者OsAHP2的磷酸基团(图3fg)→底物特异性。

OsRR21D68E突变抑制了其磷酸化(图3f)→D68可能是磷基接受位点。

GST-MHZ1接受域的D824A突变体不能将磷酸基团从MHZ1转移给OsAHP1 or OsAHP2(图3g)→MHZ1D824残基在从GST-MHZ1OsAHP1OsAHP2的磷酸转移是必不可少的

                             

MHZ1可以自磷酸化,然后通过它的接受结构域将磷酸基团转移给OsAHP1/OsAHP2,然后进一步转移给OsRR21

 

 

 

 

⑩在[γ-32P]ATP存在时,GST-MHZ1自磷酸化;

GST-MHZ1的自磷酸化水平逐渐降低,但是OsAHP1的磷酸化水平逐渐增强(图3h)→从GST-MHZ1OsAHP1是活性磷酸转移。

GST-MHZ1OsAHP1的磷转移后,进一步将OsRR21加入到测定体系中,其磷酸化水平提高(图3h

GST-MHZ1  OsRR21或者OsAHP1 OsRR21不能导致OsRR21的磷酸化(图3h

OsAHP2相似

 

GST-MHZ1, OsAHP1/2 OsRR21之间的磷酸转移体系被证实是以MHZ1介导的磷酸化体系(与上一段结论相同?)

 

 

 

 

5.乙烯信号传导需要MHZ1介导的磷酸化(论证必要性)

mhz1MHZ1G1)      无乙烯反应  存在MHZ1-FLAG蛋白

mhz1MHZ1H375Q)  无乙烯反应  存在MHZ1-FLAG蛋白

mhz1MHZ1D284A)  无乙烯反应  存在MHZ1-FLAG蛋白

  mhz1MHZ1           有乙烯反应 (图3i)  

MHZ1激酶活性、保守的H375磷酸化位点和D824磷酸基接受位点都是调控水稻根系乙烯反应的必需条件

②   Osahp1Osahp2单突       有乙烯反应

Osahp1Osahp2双突         无乙烯反应

在乙烯信号转导中,OsAHP1OsAHP2可能起冗余作用

OsRR21-OE               更短的根,乙烯应答基因表达增强

在乙烯信号转导中,OsRR21其正向调节作用

Osrr21突变体               有乙烯反应

在乙烯信号转导中,OsRR21可能起冗余作用

WT    OsRR21增强OsRAP2.8启动子活性

mhz1   无此现象

OsRR21功能需要MHZ1信号

其他几个反应调节基因的乙烯诱导这些额外的基因也可能有助于调节乙烯的反应

 

水稻根系乙烯反应需要MHZ1-AHP1/2-OsR21酸转移途径

 

 

6.MHZ1基因作用于OsERS2

mhz1+Osers2mhz1+Osetr2乙烯受体功能→丧失了根部的乙烯超敏反应→MHZ1对受体突变体的乙烯反应是必要的

②一个显性的OsERS2功能增益突变体Osers2d,测试其与MHZ1的遗传相互作用。(Osers2d是从EMS诱变群体中筛选出来的mhz12,且在OsERS2的跨膜结构域存在显性突变(A32V))(附图8

Osers2d               乙烯不敏感(图4b

  Osers2d/MHZ1-OE  完全遮蔽了MHZ1-OE的乙烯诱导的短根表型

没有改变MHZ1蛋白的含量(图4bc

在根乙烯响应中,Osers2d的功能增益突变抑制了MHZ1的功能

mhz1抑制Osers2的短根表型

 

MHZ1可能在OsERS2水平上发挥遗传功能,也可能形成复合体

 

7.OsERS2MHZ1相互作用抑制其激酶活性

①【酵母双杂】MHZ1在酵母细胞与OsERS2相互作用(图4e

②【GST pull-down】【Co-IPOsERS2可与MHZ1相互作用(图4fg

③【MeRA】分别表达时OsERS2-mCherry    网状结构

                      MHZ1-GFP        细胞质

           共表达时   MHZ1-GFPOsERS2-mCherry共定位  

OSERS2促进了MHZ1ER膜定位

④【protein fractionation】在膜组分中检测到大量MHZ1蛋白,特别是在Osers2d存在下MHZ1OsERS2在膜上结合(附图9a

1-MCP处理→膜组分中MHZ1增加

乙烯处理→膜组分中MHZ1降低(附图9b

⑥与野生型相比,Osers2dOsERS2MHZ1有更强的相互作用(附图9c

⑦为了研究OsERS2的哪个结构域介导了与MHZ1的相互作用,我们生成了OsERS2的截断版本(图4d

Co-IPGAF结构域负责OsERS2MZ1的相互作用

 

⑧【体外磷酸化试验】OsERS2增加,MHZ1组氨酸激酶活性急剧降低→OsERS2能在体外抑制MHZ1自磷酸化

                   OsERS2增加,MHZ1-介导的Os AHP1的磷酸化作用明显降低了

GAF结构域对MHZ1自磷酸化有抑制作用,激酶结构域没有

 

OsERS2可以通过其GAF结构域抑制MHZ1自磷酸化和MHZ1介导的磷酸化

 

 

⑨【蛋白质免疫印迹实验】

MHZ1OE4-4/OsERS2-mycMHZ1OE4-4/Osers2d-myc MHZ1-FLAG表达量相似,Osers2dMHZ1磷酸化的抑制作用明显强于OsERS2(图4m,附图9abc)→与野生型OsERS2相比,Osers2dMZ1的相互作用更强

mhz1:MHZ1(H375Q)       不能抑制MHZ1的组氨酸磷酸化

Osers2d:MHZ1WYMHZ1的抑制作用更强


OsERS2Osers2d抑制水稻细胞中MHZ1组氨酸磷酸化

OsERS2外,其他乙烯受体如OsERS1OsETR2也表现出与MHZ1的轻度相互作用,对MHZ1自磷酸化有中度抑制作用→乙烯受体在调节MHZ1激酶活性中的作用相似。

 

 

8.MHZ1OsEIN2的遗传相互作用

Osein2   根和胚芽鞘生长中对乙烯不敏感

 OsEIN2-OE  强构造性和增强的乙烯反应

mhz1/OsEIN2-OE  部分抑制了乙烯不敏感性,OsEIN2-OE幼苗相比,中胚轴以上的节部仍有较长的不定根(图5c

→活跃OsEIN2介导的信号通路可部分恢复mhz1突变体的乙烯反应

②乙烯下,Osein2/ MHZ1-OEMHZ1-OE的根长

空气下,Osein2/ MHZ1-OEMHZ1-OE的根明显更短(图5de

Osein2突变不能完全阻断MHZ1过表达所赋予的增强的乙烯反应,→MHZ1可能有能力接受来自上游组分的信号,例如乙烯受体,独立于OsEIN2功能

③【RNA-seq85%719)的MHZ1依赖的ERGs也受到OsEIN2OsEIL1的调节(图5f和补充数据1

MHZ1OsEIN2OsEIL1的转录下游(图2

Osein2中  五个基因诱导的乙烯反应均不存在或受阻

mhz1中  仅有OsRRA5OsRAP2.8OsERF002表达受到影响(附图11ab

mhz1Osein2对乙烯的反应性在基因表达上存在差异MHZ1依赖的ERGs只占OsEIN2依赖的ERGs的一半)

→尽管MHZ1基因部分独立于OsEIN2,但是MHZ1介导的途径与调节水稻根系生长的OsEIN2信号通路共用ERGs的一个子集

④【GO 分析】与总ERGs相比,MHZ1依赖的ERGs主要富集于生长素信号通路和对不同刺激的反应中。这与以前的研究结果一致,即乙烯在生长素信号传导的上游,起到调节根系生长的作用→MHZ1可能参与对乙烯、生长素和其它刺激的相互作用,调节根系生长。

⑤在对OsEIN2-OE的抑制子进行筛选的过程中,发现三个抑制系(SOE-7407-410-9744)与乙烯处理后的mhz1/OsEIN2-OE幼苗非常相似;通过测序确定MHZ1位于这些抑制因子中的突变位点(附图12)→MHZ1OsEIN2的遗传关系

 

五.主要方法

real-time PCRGUS染色、蛋白质磷酸化测定、水稻转化、Y2HPull-downCo-IP、膜募集实验、组氨酸磷酸化状态检测、膜蛋白分离实验、乙烯产量的测定、RNA-seq

 

六.讨论

1.本文结论与细菌研究的结论一致。绿浓假单胞杆菌的毒力部分受反应调节蛋白GacA控制,它可以从上游组氨酸激酶GacS中接收磷酰基团。另一组氨酸激酶RetS通过直接结合抑制了GacS的激酶活性,并且结合不需要RetS中保守的磷酸化位点。这两种组氨酸激酶的相互作用促进了细菌整合环境信号以控制复杂的适应过程。植物乙烯受体是结构相关的组氨酸激酶样蛋白。虽然OsERS2OsETR2显示激酶活性,但是这些激酶活性是否在抑制MHZ1信号传导方面有任何作用目前尚不清楚

2.OsERS2中的GAF结构域在与MHZ1的相互作用中具有充分的作用,在抑制MHZ1激酶活性方面起着重要作用。在所有乙烯受体中都发现了GAF结构域,迄今尚未发现其它功能。本研究揭示了其在水稻根系乙烯信号传递过程中连接下游组氨酸激酶MHZ1的作用

3.前期,包含GAF结构域的ETR1N端已被发现在很大程度上可以挽救ctr-1ctr1-2突变表型,可能暗示了在拟南芥中绕过CTR1的另一种途径。最近的一项研究还表明,ETR1通过其RD结构域与AHP蛋白相互作用,参与了多步磷酸化途径。拟南芥中的AHK5MHZ1的同系物)是否参与以上通路还需要进一步证明。

4.拟南芥中乙烯诱导的受体基因ERS1ERS2ETR2和水稻中的OsETR2基因的表达。在信号的初始生化触发和乙烯通路完整响应之后,乙烯诱导的受体基因的表达可能是作为一种让乙烯受体在后期重现锁定MHZ1的一种去敏途径。

6.[乙烯受体基因下游的两种途径的关系]在乙烯受体下游,提出了两条分支通路。显然,保守的OsCTRs-OsEIN2-OsEIL1途径应在根系和空中部分起主要作用,而MHZ1-OsAHP1/2-OsRR21途径可能在水稻根系中起特殊作用。乙烯诱导的OsEIN2mhz1mhz1/OsEIN2-OE植物中的积累不受影响,进一步证明了MHZ1在根乙烯响应中的单独作用(附图13)。保守的OsEIN2-OsEIL1途径可诱导MHZ1OsRR21的表达,这一特征可能有助于在信号激活后维持MHZ1介导的途径的稳定(图2和附图7g)。

719ERGs被确定为MHZ1OsEIN2OsEIL1共享→这两种途径可以共同调节ERGs的表达,从而调节根系生长。任何一种途径的中断都会消除这些ERG的乙烯诱导,导致水稻根系的乙烯不敏感表型。但另一方面,当任一途径中断时,另一途径的构成性激活可部分恢复下游ERGs的诱导。

7.[乙烯和细胞分裂素]双组分系统也参与拟南芥的细胞分裂素信号传递,在水稻中可能存在类似的机制。考虑到水稻可能只有两个功能HPtsOsAHP1OsAHP2)用于信号传递。因此,这两个基因可能在乙烯信号传导和细胞分裂素信号传导中根据不同的处理、时间、细胞类型、组织或器官以特定的方式发挥作用。实际上,在Osahp1(杂合子)/Osahp2(纯合)植物的168个自交后代中,仅鉴定了有限数量的纯合Osahp1Osahp2幼苗,暗示Osahp1Osahp2双突变在胚胎发育中可能存在一定程度的缺陷,这可能是由细胞分裂素信号的缺陷引起的。也不排除其他可能的存在。在丝状真菌尼杜兰曲霉中也报道了类似的含组氨酸的磷酸递质。

8.[MHZ1的其它功能]拟南芥中具有MHZ1同源基因AHK5ahk5表现根乙烯反应轻度增强,这种反应与目前水稻mhz1根完全不对乙烯敏感的反应形成对比,表明水稻可能已进化到采用MHZ1通路的不同机制,以强烈控制乙烯调节的根系生长,以适应水环境。

ahk5ABA也很敏感,mhz1ABA有点不敏感→在水稻中,MHZ1也可能参与ABA或其他与压力相关的过程。

玉米中的同系基因ZmHK9已被鉴定,该基因在根中高度表达,并由干旱和ABA处理诱导。在拟南芥中过度表达该基因表现出ABA乙烯的超敏反应,并通过调节气孔密度和气孔关闭而导致耐旱性除了在乙烯响应中的作用外,MHZ1还可能具有其他功能。

MHZ1N端有一个PAS结构域,该结构域通常参与配体或蛋白质相互作用,表明该蛋白除了受到乙烯受体的调节也存在其它感知的可能性。

MHZ1和乙烯受体都是组氨酸激酶或结构相似的蛋白质→不能排除MHZ1作为乙烯信号的细胞质共同受体的可能性

拟南芥AHK5、几种AHP和响应调节器可以形成信号网络来调节气孔关闭,以响应H2O2乙烯mhz1的根系生长对H2O2略不敏感H2O2可能通过MHZ1部分发挥作用,抑制水稻根系生长

OsHK1/MHZ1通过细胞分裂素相关途径在水稻大半径根尖环圈中发挥作用;乙烯被证明以生长素运输依赖的方式刺激拟南芥的营养MHZ1参与乙烯、生长素、细胞分裂素或H2O2之间的相互作用来调节根系生长




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