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(20200208)(文献阅读笔记)CRISPR/Cas 植物基因组编辑技术研究进展

已有 1532 次阅读 2020-2-16 12:06 |个人分类:文献阅读笔记|系统分类:论文交流

                                          CRISPR/Cas 植物基因组编辑技术研究进展


杂志:华南农业大学学报

通讯作者:刘耀光

 

一.CRISPR/Cas9系统的发展历程

1987年 日本研究团队 在大肠埃希菌 Escherichia coli中发现了串联重复序列

Mojica    20多种微生物中发现了类似的重复序列,命名为SRSRs,并总结了它的基本特征。

2002Jansen Mojica 更名为成簇的间隔短回文重复序(CRISPR

鉴定出不用原核生物中高度相似的4crispr关联基因

2005Mojica等 发现CRISPR基因座中存储了病原菌的基因信息,可能是微生物适应性免疫系统的一部分。

2007Barrangou等 证明了细菌通过识别与噬菌体序列相同的crispr间隔区对应的特定序列,获得抗性。

确认Cas7帮助细菌获得新的间隔序列和重复,Cas9发挥合算切割切割酶的作用

随后的几年,CRISPR细菌免疫系统的必要条件和作用机制相机被发现和证实。

2012  Jinek crRNAtracrRNA配对结合形成双分子RNA结构,介导Cas9蛋白定向切割DNA序列

2013  张锋等  利用CRISPR/Cas9在人类和小鼠总实现了精准的基因编辑,并构建了可同时靶向多个位点的基因编辑系统。

 

二.CRISPR/Cas系统的结构

CRISPR/Cas=CRISPR基因座+Cas基因

             ||

 富含AT碱基的前导序列Leader+涵盖回文序列的重复序列Repeater+从外源捕获的间隔序列Speacer

三.CRISPR/Cas系统的类型

图片.png


一.CRISPR/Cas9系统的建立

1. 简化系统:保留tracrRNAcrRNA的核心序列,引入连接区,将两者合并为sgRNA。并证实Cas9能在sgRNA引导下切割双链RNA

2. 最先被利用的SpCas9蛋白(来源于链球菌的Cas9蛋白)=RuvC-like结构域+HNH核酸酶

3. 在真核系统中,Cas9蛋白应添加一段核定位信号以保证该蛋白进入细胞核正常发挥功能。

4. sgRNA 是一段具有特定结构的单链 RNA,其 5'端约 20 个碱基与靶 DNA 互补配对结合,引导 Cas9/ sgRNA 复合物对相应位点进行切割,决定编辑位点特异性。→只需改变sgRNA5端的特异位点识别序列→构建多个sgRNA表达盒的串联载体,可实现同时对多靶点的进行编辑。

5. 转化方法(植物系统中):原生质体PEG转染、农杆菌叶片注射法、基因枪轰击、农杆菌介导转化等

6. CRISPR/Cas12a的比较


CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas12a

Cas蛋白的结构

RuvC-like结构域+HNH核酸酶

RuvC-like结构域

引导RNA

sgRNAtractRNA+crRNA

crRNA

切割位点

DNAPAM序列上游3nt处→平末端

DNAPAM序列下游18nt(正链)和23nt(负链)→黏性末端

识别PAM序列的类型

NGG

富含T

7. CRISPR/Cas12a系统的优势

(1)crRNAsgRNA更短,且Cas12a蛋白比Cas9蛋白更小→适用于装载量更小的载体系统,特别是多靶点编辑的情况。

(2)黏性末端,增加了HDR修复途径发生的概率,有利于DNA片段的定点插入和替换。

(3)在多个物种的基因编辑中,其脱靶率更低。

 

 

 

二.CRISPR/Cas9在植物基因组编辑中的应用

1. 功能基因的敲除

原理:Cas9蛋白切割目标DNA形成双链断裂→NHEJ易错修复途径

Indel

图片.png

1. 基因(片段)的定点插入或替换

原理:Cas9蛋白切割目标DNA形成双链断裂—引入供体片段HR修复途径—同源重组→供体片段的精确插入或替换

优势:可实现多个控制优良性状基因的稳定聚合,解决传统育种中优良形状无法连锁遗传的问题

局限性:插入抗性基因,依赖于采用筛选剂富集编辑细胞,编辑效率低

技术改良

图片.png

1. 单碱基编辑

CBE=胞嘧啶脱氨酶+nCas9sgRNA→非靶标链:CU(靶点PAM序列上游5~12nt             →靶标链:被切割,GA

ABE=腺苷脱氨酶+nCas9

2. 基因的表达调控

Cas9蛋白对目标基因的启动子区的CRE进行编辑或直接删除→随机性高,未必能获得理想性状

            dCas9蛋白+转录调控结构域—sgRNA→抑制或激活目标基因的表达

   dCas9蛋白+乙酰转氨酶等蛋白→表观遗传编辑(植物中报道较少)

dCas9蛋白:人工突变后失去核酸酶活性,仍保留DNA结合能力)

 

一.CRISPR基因编辑靶点的分析技术

1. 基于Sanger测序的靶点分析技术

1)经典的解码方法:

构建克隆,并挑取多个克隆进行Sanger测序

利用特异引物           纯合突变株可与野生型和突变株序列对比获知

直接将PCR产物测序

                     双等位突变和杂合突变,测序峰图会出现双峰

(2)简并序列解码DSD

2. 基于高通量测序的靶点分析技术

3. 基于非测序手段的靶点分析技术

图片.png

一.基因编辑技术的脱靶风险评估

1. 脱靶效应:在基因编辑过程中,CRISPR系统对非靶标位点进行非特异编辑从而导致不可控的基因组变异。

2. 脱靶情况的出现与靶序列的特异性有关

3. Cas蛋白介导的NEHJ途径的编辑具有较高的特异性→解决途径

4. ABE相比于CBE有较高的编辑特异性→解决途径

 

二.展望

图片.png

二代测序+基因编辑技术→研究植物基因功能

 

郭东灵于202028日学习记录




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