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知识分享:IPTG诱导蛋白表达的实验方法

已有 333 次阅读 2020-1-15 15:59 |系统分类:科研笔记

知识分享:IPTG诱导蛋白表达的实验方法

实验原理:

E.coli乳糖操纵子(元)含ZYA三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节 基因II基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激 活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表


在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶P序列结 合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经β-半乳糖苷酶催化,转变为异乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的作用与异乳糖相同,是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。


实验试剂

1LBLuria-Bertani)培养基:酵母膏(Yeast extract)5g 蛋白胨(Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2% 蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0

2IPTG 贮备液:2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中,0 . 22 μm 滤膜过滤除菌,分装成1 mL /份,-20 ℃ 保存

3凝胶电泳加样缓冲液 50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS (电泳级) 0.1 % 溴酚蓝 10 % 甘油


实验步骤:

1、用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因;

2、按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到转化DH5α感受态细胞中;

3、分别挑取单菌落接种于5 mL LB ( 0.1 g·L-1 氨苄青霉素)中,37℃培养过夜;

4、以2 %体积比转接于2 ml LB( 0.1 g·L-1 氨苄青霉素)中,37℃继续培养2.5 hr,至细菌对数生长期,加0.1 mmol/L IPTG 2 μl诱导3-4 hr,同时设立不加IPTG诱导作为对照; 

5、取上述菌液1 mL12000 rpm离心10min,收菌沉淀;

6、重悬于冰的100 μl PBS中,加入PMSF至终浓度为10 mmol/L。震荡器震荡混匀,加入2×加样缓冲液,煮沸10 min变性,12,000 rpm离心10 min

7、分别取诱导前和诱导后的样品10 μl进行SDS-PAGE电泳分析。

PS:如果表达载体的原核启动子为PL 启动子,则在30 -32 ℃培养数小时,使培养液的OD6000.4-0.6,迅速使温度升至42  继续培养3 -5h ;如果表达载体的原核启动子为tac 等,则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L,继续培养3 -5h




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