yimingxibao的个人博客分享 http://blog.sciencenet.cn/u/yimingxibao

博文

知识分享:原核蛋白的表达、分离和纯化

已有 435 次阅读 2020-1-15 15:02 |系统分类:科研笔记

知识分享:原核蛋白的表达、分离和纯化

实验原理:

携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中,在37℃IPTG诱导下,超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白,该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸(NTA)使镍离子(Ni2+)固相化的层析介质加以提纯,实为金属熬合亲和层析(MCAC)。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。


实验材料:

大肠杆菌BL21

试剂、试剂盒:

LB液体培养基、氨苄青霉素、Washing BufferElution BufferIPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠

仪器、耗材:

摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒

实验步骤:

一、试剂准备

1. LB液体培养基:Trytone 10 gyeast extract 5 gNaCl 10 g,用蒸馏水配至1000 mL

2. 氨苄青霉素:100 mg/mL

3. 上样缓冲液:100 mM NaH2PO410 mM Tris8M Urea10 mM 2-MEpH8.0

4. Washing Buffer100 mM NaH2PO410 mM Tris8 M UreapH6.3

5. Elution Buffer100 mM NaH2PO410 mMTris8M Urea500 mM ImidazolepH8.0

6. IPTG100mM IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于100ml ddH2O,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。


二、获得目的基因

1. 通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。

2. 通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

三、构建重组表达载体

1. 载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2. PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

四、获得含重组表达质粒的表达菌种

1. 将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。

2. 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

3. 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。


五、重组蛋白的诱导

1. 接种含有目的基因蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5 mL LB液体培养基中(含100 ug/mL 氨苄青霉素),37℃震荡培养过夜。

2. 1∶501100的比例稀释过夜菌,一般转接1 mL过夜培养物于100 mL(含100 ug/mL 氨苄青霉素)LB液体培养基中,37℃震荡培养至OD600 = 0.6 -0.8(最好0.6,大约需3 h)。取10 ul 样品用于SDS-PAGE 分析。

3. 对照组不加诱导剂,实验组加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l37℃继续培养1-3h

4. 12 000 rpm 离心10 min,弃上清,菌体沉淀保存于-20℃-70℃冰箱中。

六、重组蛋白的分离、纯化

1. NTA层析柱的准备:在层析柱中加入1 mL NTA介质,并分别用8 mL 去离子水,8 mL上样缓冲液洗涤。

2. 重组蛋白的变性裂解:在冰浴中冻融菌体沉淀,加入5 mL上样缓冲液,用吸管抽吸重悬,超声波破裂菌体,用振荡器等轻柔的混匀样品60 min4℃12000 rpm 离心30 min,将上清吸至一个干净的容器中,并弃沉淀。取10 ul 上清样品用于SDS-PAGE 分析。

3. 上清样品以10-15 mL/h 流速上Ni2+-NTA柱,收集流出液,取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。

4. 洗脱杂蛋白:用Washing Buffer10-15 mL/h流速洗柱,直至OD280 = 0.01分步收集洗脱液,约3-4 h,取10 ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE 分析。

5. 洗脱目标蛋白:用Elution Buffer洗柱,收集每1 mL 级分,分别取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。


注意事项

1. 选择表达载体时,要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化,可选择融合表达;如为获得天然蛋白,可选择非融合表达。

2. 融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时,对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。

3. 菌液OD值要小于1,否则细胞太浓太老,不易破碎,且质粒易丢失。

4. 诱导时间最好做一个梯度,不同蛋白诱导时间需摸索。

5. 诱导温度适当摸索

6. IPTG浓度:一般在1 mM 以内,可适当摸索。

7. 超声条件可视实际情况改变,只要使菌体裂解充分即可,即菌液清亮不粘稠

 




http://blog.sciencenet.cn/blog-3425709-1214359.html

上一篇:知识分享:原代细胞的制备、培养
下一篇:知识分享:AAV在肺部的应用

0

该博文允许注册用户评论 请点击登录 评论 (0 个评论)

数据加载中...

Archiver|手机版|科学网 ( 京ICP备07017567号-12 )

GMT+8, 2020-2-28 08:40

Powered by ScienceNet.cn

Copyright © 2007- 中国科学报社

返回顶部