北京时间2024年3月22日晚，美国麻省理工学院化学系/Broad研究所王潇团队在Nature Biotechnology发表了题为“Branched chemically modified poly(A) tails enhance the translation capacity of mRNA”的研究论文。

研究人员通过结合寡聚核糖核酸化学合成和信使RNA(mRNA)酶合成方法在mRNA尾部引入非天然化学修饰和枝状拓扑结构，极大提高了mRNA在细胞和小鼠内的稳定性和总体蛋白表达，为mRNA药物的化学修饰空间提供了新见解。

信使RNA(mRNA)药物作为一类新兴药物可有效递送任何治疗用蛋白，可被广泛应用于疫苗，基因疗法，蛋白质替代疗法，抗体疗法等重要重要领域。虽然疫苗仅需瞬时的抗原表达即可激活免疫反应，蛋白疗法在多数情况下拥有更高的治疗阈值，需要更长时间的大量蛋白表达，因此如何提高mRNA的稳定性和单分子翻译能力成为限制该疗法更为广泛应用的关键问题。

现有的mRNA疗法受限于其较短的半衰期，尤其是3’端外切酶介导的降解。大量前期研究曾试图解决这一问题。例如，环状RNA(circRNA)通过RNA环化令其失去暴露的末端来规避外切酶降解，然而circRNA缺少5’帽结构，依赖于较低效率的内部核糖体进入位点(IRES)来介导RNA翻译；除此之外，由于非天然核糖核酸会影响二级结构从而抑制内含子介导的反向剪切环化效率，环状RNA无法可控地引入化学修饰。类似的限制也存在于自复制RNA(self-amplifying RNA), RNA介导的核糖核酸聚合酶产生的RNA不含帽结构而依赖于IRES，同时这些聚合酶所识别的RNA二级结构多为双链且无法被化学修饰，因此具有较强的免疫原性。研究团队因此希望寻找不牺牲5’帽结构同时和N1-甲基伪尿嘧啶可兼容的RNA稳定策略。

天然mRNA翻译多数由5’帽和3’多聚腺嘌呤核糖核酸(poly(A))尾介导。真核翻译起始因子识别mRNA的5’帽形成翻译起始复合体，而多聚腺嘌呤核糖核酸结合蛋白(PABP)识别mRNA的poly(A)尾并与5’翻译起始复合体相互作用形成伪环状结构从而高效地产生蛋白。该课题组过去曾通过在poly(A)尾部用T4 RNA连接酶特异性地引入具有核酸外切酶抗性的化学修饰，显著提高了mRNA的稳定性。基于PABP常常会以多聚体的形式结合poly(A)尾的特性，研究人员推理通过给单个mRNA引入多条末端修饰的poly(A)尾可以更好的增强其对3’外切酶的抗性以及PABP-翻译起始复合体间相互作用，从而增强mRNA的稳定性以及翻译效率。基于此设计，研究人员利用带有乙炔/叠氮的化学合成末端修饰的寡聚核糖核酸，利用点击化学构造枝状结构并通过反相高效液相色谱提纯枝状poly(A)寡聚核糖核酸，最后用T4 RNA连接酶将其接入体外转录合成的带5’帽/N1-甲基伪尿嘧啶的全长mRNA。通过表达荧光素酶，研究人员筛选出带有三条枝状硫代磷酸酯/2’-甲氧基乙基的poly(A)可在HeLa细胞/小鼠内持续两周产生可检测的荧光信号。通过采用优化后的mRNA来递送Cas9蛋白，研究人员在细胞与小鼠内成功实现了低剂量mRNA下更高的基因敲除效率。

图：a)未保护的mRNA容易被从末端降解。b)含有多条化学修饰的poly(A)尾的mRNA设计。

机制上，团队使用了该课题组研发的空间原位RNA检测方法STARmap来检测整体RNA数量，RIBOmap来检测被核糖体结合的RNA数量，通过两者的比值来计算相对翻译效率。值得注意的是，STARmap/RIBOmap有效的过滤了大量被滞留在胞内体内的转染RNA，比传统的定量反转录PCR更确切地反映了细胞质内的外源RNA状态。研究人员发现，在HeLa细胞内，3’端化学/拓扑修饰均未显著增强或抑制RNA的早期翻译效率，但随着时间增加，同时带有多条poly(A)尾和化学修饰的mRNA具有更高的翻译效率。作者在小鼠内观察到同样的趋势，转染24小时后，末端修饰的mRNA更稳定，而带有多条poly(A)尾的mRNA同时具有更高的翻译效率。研究人员在体外确认了PABP对枝状poly(A)结构的兼容性，并确认了末端硫代磷酸酯/2’-甲氧基乙基对CAF1-CCR4去腺苷酸酶复合体的抑制性，证明了化学修饰和枝状结构同时保持了poly(A)尾的完整性以及与PABP的结合数量。研究团队证明了末端选择性修饰mRNA这一策略的可行性以及RNA翻译机制对非天然链接结构的兼容性，为mRNA药物的设计提供了新思路。

博士生陈泓宇为论文的第一作者，博士生刘当亮、郭健庭、和Abhishek Aditham也为课题做出了突出贡献。

相关论文信息：

https://www.nature.com/articles/s41587-024-02174-7