北京时间2024年1月2日，美国芝加哥大学汤玮欣团队在Nature Biotechnology杂志上发表了题为“An adenine base editor variant expands context compatibility”的研究论文。

该论文通过巧妙的定向进化设计，从野生型E. coli TadA出发，经历五轮定向进化，获得了具有更高活性与更好序列兼容性的TadA8r，拓宽了ABEs在疾病治疗的应用范围。

芝加哥大学化学系汤玮欣教授为该文通讯作者，博士后肖玉兰为第一作者，博士研究生吴元也为该文做出了重要的贡献。

目前约有60%的人类遗传性疾病源自于DNA上的单碱基突变，其中约有一半单碱基突变属于C:G到T:A的转换。腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）是进化的E. coli tRNA腺苷脱氨酶（TadA*）与Cas9缺口酶（nickase）的融合蛋白，它可以在不依赖双链DNA断裂的情况下实现A:T到G:C的转换，从而纠正C:G到T:A的突变，未来有望成为治疗这类因C:G到T:A突变导致的遗传性疾病的首选方法。

然而，目前已知的ABEs都具有一定的“TA”序列偏好性，它们在编辑“RA”（R = 嘌呤碱基；G 或A）序列时表现出相对较低的效率。最早报道的ABE7.10或者ABEmax中的TadA7.10是从野生型E. coli TadA出发经历七轮定向进化获得的，其具有非常强的“TA”序列偏好性。这一“TA”序列偏好性主要由两个因素决定：（1）野生型TadA的底物特异性，野生型TadA特异性编辑精氨酸tRNA反密码子环的(U)ACG序列；（2）筛选位点的序列，定向进化中使用的5个筛选位点中有4个需要编辑“TA”序列。TadA8与TadA8e是在TadA7.10的基础上经历了更多轮进化获得的，它们具有更高的活性，然而其对“TA”序列的偏好性依然存在。对于这些蛋白，“RA”序列仍然是具有挑战性的底物。当目标A位于强编辑窗口之外或者当ABEs的递送效率低下时，ABEs的这一“TA”序列偏好性表现的尤为显著。ABEs的序列偏好性导致目前基于ABEs的临床相关研发项目几乎一致性靶向“YA” （Y = 嘧啶碱基；T 或C）序列，这极大的限制了ABEs在“RA”序列相关疾病治疗中的应用。

为了提高ABE在“RA”序列上的活性，研究人员构建了一套基于细菌抗生素抗性基因编辑的高通量筛选系统。研究人员将GATC序列置于抗生素抗性基因中，GATC的安装会导致抗生素抗性蛋白失活，只有当GATC序列被有活性的TadA*编辑为GGTC之后才能使抗生素抗性蛋白恢复活性。在E. coli中，几乎所有GATC 中的 A均被 DNA 腺嘌呤甲基转移酶 （Dam）在 N6 位甲基化。TadA*无法接受甲基化的A为底物， 仅有DNA 复制过程中瞬时产生的未甲基化链可以成为TadA*的底物，即TadA*必须与Dam竞争底物。这种设计不仅迫使TadA*接受“RA”底物，同时还施加了更大的选择压力用于筛选具有更快脱氨酶活性的TadA*。从野生型TadA出发，经历五轮定向进化，研究人员获得了具有更高编辑活性与更好序列兼容性的TadA8r。

在体外动力学试验中，TadA8r在“GA”序列上的脱氨速率是目前两种活性最高突变体TadA8.20与TadA8e的9.5倍与11.1倍；在“TA”序列上的脱氨速率是TadA8.20与TadA8e的2.9倍与1.8倍。

研究人员在约12000个疾病相关位点上系统性评估了ABE8r的编辑效率，编辑窗口，以及序列偏好性等。TadA8r向PAM远端拓宽了ABE8r的编辑窗口。除了在编辑“TA”序列时，ABE8r稍逊色于ABE8e之外，ABE8r在其他“CA”，“GA”以及“AA”序列上都表现出高于或者相当于其他ABEs的平均编辑效率。在纠正基因组中9407个与疾病相关的G到A突变位点时，ABE8r在其中41.9%的位点表现出优于ABE7.10,  ABE8.20以及ABE8e的编辑效率。

TadA8r与其他CRISPR系统具有很好的兼容性，包括兼容具有更宽松PAM识别序列的其他SpCas9变种，SaCas9与其变种，LbCas12a及enAsCas12a等。在保持高的在靶编辑效率的同时，ABE8r还表现出显著低于ABE8e的DNA与 RNA水平脱靶效应。

由于具有更宽的编辑窗口与更好的序列兼容性，ABE8r可以有效编辑其他ABEs难以编辑的疾病相关位点。例如在纠正导致Stargardt疾病的ABCA4 C.5882G>A （G1961E）突变时，ABE8r具有显著高于ABE7.10,  ABE8.20以及ABE8e的编辑效率。

ABE8r 作为具有更高活性与更好序列兼容性的腺嘌呤碱基编辑器，拓宽了ABEs在疾病治疗的应用范围。由于TadA8.20已被成功应用于m6A检测（eTAM-Seq. Xiao, YL., Liu, S., Ge, R. et al. Nat Biotechnol 41, 993–1003 (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01587-6）， 凭借超高脱氨活性和更广泛的序列兼容性，TadA8r 可能会加速用于核酸操作的复杂分子生物学工具的开发。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1038/s41587-023-01994-3