DNA双链断裂（double-strand break，DSB）是细胞内危害很强的DNA损伤方式，未及时修复的DNA双链断裂与细胞癌变密切相关。非同源末端连接修复（non-homologous end-joining, NHEJ）是细胞内主要的DNA双链断裂修复方式之一。与同源重组不同，由于不需要同源DNA作为修复模版，NHEJ在细胞周期的各个阶段均可修复断裂DNA。NHEJ还参与多样性抗体与T细胞受体的重组过程。

在NHEJ中,DSB末端首先被Ku70/80识别并结合，之后与DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PKcs）结合组成DNA-PK复合体，即NHEJ起始复合体（DNAPK）。继而，两个DNAPK将断裂的DNA末端结合，同时招募后续的NHEJ修复因子（XRCC4与XLF）以及DNA连接酶IV（LigIV）将断裂的DNA修复。近二十年来，人们一直在研究这个重要的DNA修复途径，其中重要蛋白的分子结构也陆续被解析，然而，人们仍不清楚这些因子如何相互配合，从而在NHEJ通路中聚合并排列两个断裂的DNA末端，完成DNA修复。

通过不断优化与尝试不同的DNA底物，何源课题组将LR复合体结构分辨率解析至4.6Å，其中DNA-PKcs的分辨率达到4.1Å。利用已有的各蛋白结构，他们搭建了LR复合体包含两个DNAPK复合体、两个XRCC4/LigIV复合体及一个XLF二聚体的模型（图 1）。之前，研究者们一直对NHEJ中参与断裂DNA整合的因子组成有不同的假说，有的认为DNA-PKcs与DNA结合，通过二聚来连接两个断裂DNA末端，其他人则认为XRCC4与XLF可以通过重复聚合形成长链来连接DNA。

何源课题组的LR复合体是第一个包含所有必要NHEJ蛋白与两个DNA末端的复合体结构模型，其中，DNAPK的二聚与XRCC4/XLF的相互作用共同协助，同时对复合体的形成与DNA末端的连接起到了重要作用。对DNA-PKcs多年的研究表明，DNA-PKcs在NHEJ中倾向于磷酸化自身靶点，同时脱离招募它的底物DNA来推动NHEJ进入下一步骤。本研究中的LR复合体结构进一步支持了DNA-PKcs自磷酸化的反式作用机制，即二聚的蛋白在复合体中相互磷酸化，保证NHEJ的进行过程包含两个所需的DNA末端。

图1，LR复合体结构的电镜结构。a, LR复合体的冷冻电镜正视 (左) 与俯视 (右)密度图。b, LR复合体在对应视角下的分子结构模型。

在此基础上，何源课题组还将不含DNA-PKcs，柔性更强的SR复合体重组并解析至约7Å分辨率（图 2）。尽管SR复合体并不包含DNA-PKcs，但其它NHEJ因子的整体结构与相互接触表面并未大幅变动。相应地，Ku70/80与XRCC4、XLF的局部构象变化将SR复合体中的DNA末端完整对接，同时一个连接酶IV的催化结构域与复合体中央的DNA末端相互作用，最终将断裂DNA完整连接（视频1）。单独的连接酶IV被认为只能完成一个DNA链的修复循环，因此，SR复合体中的两个连接酶IV催化结构域可以依次与DNA末端结合，分别将两个断裂的单链修复。

有趣的是，DNA-PKcs在离开修复位点后，其暴露的DNA结合区域长度正好与形成稳定SR复合体所需的DNA长度相仿，这也可能解释了DNA-PKcs通过离开DNA底物来辅助SR复合体形成的分子机制。

图2，SR复合体结构的电镜结构。a, SR复合体的冷冻电镜正视 (左) 与俯视 (右)密度图。b, SR复合体在对应视角下的分子结构模型。各蛋白着色与图 1相同。

综合上述发现，何源课题组的这项工作几乎展示了一个完整的NHEJ识别、连接并修复两条断裂DNA的完整途径，为研究者在更加宏观、综合的层面上理解NHEJ提供了新的视角。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1038/s41586-021-03458-7