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杨荟/Dinshaw J. Patel/丁建平合作揭示RNA互补抑制Cas13活性的机制

已有 545 次阅读 2021-1-20 11:29 |个人分类:小柯生命|系统分类:论文交流

北京时间2021年1月20日凌晨0时,中科院分子细胞科学卓越创新中心杨荟研究组、美国纪念斯隆凯特琳癌症中心Dinshaw J. Patel研究组和中科院分子细胞科学卓越创新中心丁建平研究组合作在Molecular Cell杂志上在线发表文章——“Structural basis for self-cleavage prevention by tag:anti-tag pairing complementarity in Type VI CRISPR-Cas systems”。


该研究揭示了目标RNA的anti-tag序列与crRNA重复区形成的RNA双链抑制Cas13a活性的分子机制。


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CRISPR-Cas13系统是细菌和古细菌中通过单个Cas蛋白降解外源入侵RNA的获得性免疫系统,相应的效应蛋白Cas13在crRNA介导下序列特异性识别并切割单链RNA,被激活的同时还会非特异性切割周围环境中的RNA。


Cas13是近年来一种新兴的RNA编辑工具,在不改变基因组序列的前提下,可以进行RNA水平的敲低、RNA的定点编辑、RNA的定位等,在基因和RNA的功能研究、疾病诊断和靶向治疗等方面有巨大的潜力和应用前景。


研究发现当目标RNA靶向序列的下游可以与crRNA重复区的3’端(tag)连续配对时,对Cas13a的活性有显著抑制作用,防止宿主细胞Cas13 系统的自我靶向,与tag区域配对的序列称为anti-tag。

 

已有的研究阐明了Cas13a对目标RNA特异性识别的分子机制,并发现目标RNA的装载使HEPN结构域从失活变为激活状态。在此基础上,研究人员首先对Leptotrichia shahii和Leptotrichia buccalis两种Cas13a进行体外酶活和体内RNA干扰研究,发现当目标RNA存在5nt以上anti-tag序列时,Cas13a对目标RNA和周围环境中的RNA的切割活性显著被抑制,对大肠杆菌细胞的RNA干扰活性也显著降低。


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Anti-tag RNA的结合使HEPN结构域处于失活状态

 

随后,研究人员获得了含有8nt长度anti-tag序列的RNA与LshCas13a复合物的冷冻电镜结构,发现目标RNA的靶向区与crRNA间隔区形成RNA双链,同时目标RNA的anti-tag序列与crRNA的tag区形成的RNA双链。


与已有的结构比较发现,含有anti-tag序列的目标RNA的结合,引起Cas13a结构域的相对移动,使Cas13a呈现出与正常目标RNA装载前后均不相同的构象。Tag:anti-tag双链的形成,阻碍了HEPN结构域活性中心关键氨基酸的靠近,使HEPN结构域保持失活状态,从而抑制Cas13a对目标RNA和周围环境中RNA的切割活性,进而影响在大肠杆菌细胞RNA干扰的效果。

 

该研究工作得到张江实验室国家蛋白质科学研究(上海)设施电镜分析系统、南方科技大学冷冻电镜中心、上海科技大学冷冻电镜中心、浙江大学冷冻电镜中心、美国纪念斯隆凯特琳癌症中心电镜平台、国家蛋白质科学研究(上海)设施BL18U1和BL19U1线站的大力支持。


相关论文信息:

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.12.033




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