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周鸣/颜宁课题组揭示脂肪合成关键酶DGAT1结构及催化机制 精选

已有 4551 次阅读 2020-5-14 13:16 |个人分类:小柯生命|系统分类:论文交流

三酰甘油酯(triacylglycerol, TAG)是生命体中主要的能量储存物质,其合成过程主要有两种路径:3-磷酸甘油路径以及单酰基甘油路径(1)。


两种合成路径的最终一步都是二酰甘油酯(diacylglycerol,DAG)的酰基化从而产生TAG,而这一过程是由二酰甘油酰基转移酶(Diacylglycerol-O-Acyltransferase, DGAT)催化完成(2)。


人体中有两种序列不同源的DGAT,DGAT1和DGAT2。


DGAT1 主要负责脂肪吸收及储存过程中TAG的合成,DGAT2则负责各组织及皮肤基本脂肪的平衡。


前期研究表明,DGAT1敲除的小鼠能保持正常的代谢,并且可以抵抗高脂肪饮食引起的肥胖,而DGAT2敲除的小鼠则由于皮肤脂肪的缺失在出生数小时内脱水死亡(3)。


因此,DGAT1被认为是重要的治疗肥胖及糖尿病的药物靶点(4)。


根据序列同源性,DGAT1属于跨膜O-酰基转移酶超家族(Membrane-bound O-acyltransferase superfamily, MBOATs)。


MBOATs 超家族是一类广泛存在于不同物种中的多次跨膜酰基转移酶,其成员包括:催化TAG合成的DGAT1(5),催化胆固醇酯化的ACAT(Acyl-CoA: cholesterol Acyltransferase )(6),以及催化蛋白质脂修饰的PORCN(Porcupine)(7)等。


前期虽然有很多DGAT1功能相关的研究,但针对其多聚物分子结构、底物识别方式以及反应机理依旧没有明确的结论。



北京时间2020年5月13日晚23时,美国贝勒医学院周鸣教授课题组和普林斯顿大学颜宁教授课题合作在Nature上发表文章“Structure and mechanism of human diacylglycerol-O-acyltransferase 1”。

该工作利用单颗粒冷冻电镜技术,首次解析了分辨率为3.1Å人源DGAT1的同源二聚体结构,并结合酶活性实验,确定了酰基辅酶A(acyl-CoA)在DGAT1上的结合位点。

 

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在体外过表达并纯化得到人源DGAT1后,研究人员发展了一种酶联反应测试:利用α-酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutarate dehydrogenase,αKDH)将DGAT1产生的CoA转化为琥珀酰-CoA,同时生成NADH。


因此通过NADH的荧光来间接测量DGAT1的活性。结果显示,纯化后的人源DGAT1保持较高活性。


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结构显示,DGAT1单个DGAT1分子主要由9个跨膜α螺旋组成(transmembrane helix, TM)。


两个DGAT1分子形成同源二聚体,二聚体中心为TM1和N端无规则卷曲与另一个DGAT1分子之间形成紧密的相互作用,中间的空间由纯化所用的去垢剂和蛋白结合的脂质分子填充。


剩下的TM2-TM9以及胞内卷曲IL1/IL2在内质网膜中形成一个帐篷形状的结构,其中心有一个很大的疏水空腔。


因为此结构与其他MBOATs成员(DltB以及ACAT1)的结构有明显的共性,研究人员命名为MBOAT 结构(MBOAT fold),其中的空腔命名为反应室(reaction chamber)。


根据前期研究及序列保守性, DGAT1的活性中心H415/E416位于TM7中部,朝向反应室中。


反应室有两个开口:一个小的开口在反应室的底部TM7-TM8-IL2之间,另外一个大的开口在TM4-TM6-IL1之间,将反应室延伸向内质网膜中。

 

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acyl-CoA结合于反应室小开口处,一直延伸到反应室内部。


CoA部分结合于开口处IL2以及TM8上的极性残基,CoA向内延伸至活性位点附近,acyl-CoA的脂肪链则结合于反应室内高度疏水的口袋中。


与acyl-CoA相互作用的多数残基在DGAT1中高度保守,并且突变后对DGAT1活性有显著影响。


之前被认为是acyl-CoA结合位点的N端卷曲(8)以及FYXDWWN结构域(9)则与acyl-CoA并无直接相互作用。


结构中虽然未确认DAG的结合位点,但研究人员在结构中发现,反应室大开口附近的残基多为非极性残基,且在大开口附近有类似脂肪链的分子结合。


因此推断DAG很可能从大开口进入反应室中,从而接近于活性中心H415/E416。


之后DAG的羟基被H415活化从而进攻acyl-CoA的硫醇基团,从而引起酰基转移反应的发生。


最终,生成的产物TAG同样通过反应室的大开口释放到内质网膜中。

 

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综上,本研究中报道了首个人源DGAT1同源二聚体结构以及其底物acyl-CoA的结合位点,对于针对DGAT1靶点抑制剂开发有重要指导作用。


另外,DGAT1的结构也将为MBOATs超家族中其他成员的结构及功能研究提供重要的信息。


本文第一作者为贝勒医学院博士生王列普林斯顿大学钱洪武博士、韩亦沫博士以及贝勒医学院的年寅博士为共同一作。


韩亦沫博士现为莱斯大学助理教授,年寅博士现为中科院昆明动物所研究人员。


贝勒医学院周鸣教授课题组利用晶体学、冷冻电镜、电生理等生物物理手段,致力于研究膜转运的分子生理学、通道与载体的结构及功能调控、脂代谢酶的结构与功能。


此外,普林斯顿大学颜宁教授课题组还在同期Nature中发表文章“Structural basis for catalysis and substrate specificity of human ACAT1”。


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本文第一作者为普林斯顿大学钱洪武博士北大-清华生命科学联合中心赵馨、西湖大学鄢仁鸿为共同一作,钱洪武博士和颜宁教授为本文共同通讯作者。


该工作首次解析了分辨率为3.0Å和3.1 Å人源ACAT1的同源二聚体以及四聚体结构,并结合相关活性实验,确定了酰基辅酶A(acyl-CoA)在ACAT1上的结合位点以及底物识别的机理。

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周鸣教授课题组合影,左起二为王列,左起四为周鸣教授

 

相关论文信息:

DOI:10.1038/s41586-020-2280-2

DOI:10.1038/s41586-020-2290-0


参考文献

1.Coleman, R. A. & Mashek, D. G. Mammalian Triacylglycerol Metabolism: Synthesis, Lipolysis, and Signaling. Chem. Rev. 111, 6359–6386 (2011).

2.Yen, C.-L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C. & Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. J. Lipid Res. 49, 2283–301 (2008).

3.Smith, S. J. et al. Obesity resistance and multiple mechanisms of triglyceride synthesis in mice lacking Dgat. 25, 87–90 (2000).

4.DeVita, R. J. & Pinto, S. Current status of the research and development of diacylglycerol O-acyltransferase 1 (DGAT1) inhibitors. J. Med. Chem. 56, 9820–5 (2013).

5.Cases, S. et al. Identification of a gene encoding an acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase, a key enzyme in triacylglycerol synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 13018–13023 (2002).

6.Das, A., Davis, M. a & Rudel, L. L. Identification of putative active site residues of ACAT enzymes. J. Lipid Res. 49, 1770–81 (2008).

7.Logan, C. Y. & Nusse, R. THE WNT SIGNALING PATHWAY IN DEVELOPMENT AND DISEASE. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. (2004). doi:10.1146/annurev.cellbio.20.010403.113126

8.Panigrahi, R. et al. Intrinsic disorder in the regulatory N-terminal domain of diacylglycerol acyltransferase 1 from Brassica napus. Sci. Rep. 8, 1–13 (2018).

9.Guo, Z., Cromley, D., Billheimer, T. J. & Sturley, L. S. Identification of potential substrate-binding sites in yeast and human acyl-CoA sterol acyltransferases by mutagenesis of conserved sequences. J. Lipid Res. 42, 1282–1291 (2001).




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