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Molecular Cancer Therapeutics:细胞呼吸能力与能量储备程度可预测癌症抑制性药物的敏感性

已有 693 次阅读 2019-9-25 11:38 |系统分类:科研笔记| 细胞能量代谢, 二甲双胍


参考文献:Teh JT, Zhu WL, Newgard CB, Casey PJ, Wang M (2019) Respiratory capacity and reserve predict cell sensitivity to mitochondria inhibitors: mechanism-based markers to identify metformin-responsive cancers. Mol Cancer Ther 18:693-705.

 

二甲双胍已被广泛应用于癌细胞代谢和抗癌潜力的研究。尽管有证据表明服用二甲双胍的糖尿病患者的癌症发生率显着降低,但该药物的II期癌症试验未能达到理想效果,很可能是因为缺乏基于分子机制的实验基础。。为了验证二甲双胍对癌症有抑制作用,新加坡国立大学在基因敲除和药理学抑制电子传递链组分来降低呼吸能力的研究中,发现线粒体呼吸能力和能量储备能力(在癌细胞中差异很大)与体外及体内的二甲双胍抑制癌细胞生长的敏感性密切相关。,研究者将实验研究扩展到22个不同组织来源的癌细胞系,包括肺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、皮肤癌和卵巢癌细胞。这些癌症细胞系对二甲双胍抑制增殖表现出广泛的敏感性(35倍),并且它们的敏感性似乎与组织来源无关。这些数据证实了二甲双胍的癌细胞生长抑制作用与癌细胞自身的最大呼吸能力和能量储备能力具有一定的相关性。

 

实验一:该实验通过测量22种人体癌细胞系发现,细胞最大呼吸能力和细胞储备能力与二甲双胍的癌症抑制作用具有相关性

细胞基础呼吸水平代表了一定条件下细胞的呼吸水平,但是不能表明细胞应对一定压力或者应激的能力。而细胞最大呼吸能力(Max.resp.capacity RC)和细胞储备能力(Respiratory reserve RR)则表现了细胞能够承受刺激和应对外界压力的特性。研究者对22种人体癌细胞系的RR与RC分别进行的监测,并加入二甲双胍观察期间癌细胞的生长情况。结果发现:RR和RC能力较强的癌细胞,其二甲双胍的抑制作用降低;而RR/RC能力较弱的癌细胞,其二甲双胍的抑制作用较强。说明癌细胞RR/RC的能力与二甲双胍的抑制作用有较高的相关性。

图1:细胞最大呼吸能力和细胞储备能力与二甲双胍对癌细胞生长抑制作用具有较高的相关性(R2=0.601和R2=0.669),如图A、图B;而细胞的基础呼吸代谢与二甲双胍对癌细胞的抑制作用的相关性较低(R2=0.216),如图C

实验二:取生物体内癌细胞组织样本,监测其RR/RC的呼吸能力,并同时观测二甲双胍对癌细胞生长抑制作用,实验证明生物体内的这种相关性与体外实验具有高度一致性

上文中,研究者发现在体外癌细胞系中,二甲双胍的癌细胞抑制作用与癌细胞自身的RR/RC的能力之间具有一定的相关性;那么,另一点非常重要的是,在生物体内是否仍然具有相关性呢?研究者取活体动物肿瘤组织的癌细胞(来自与体外相同的癌细胞系的),进行呼吸代谢测量与细胞组织培养等研究。发现活体动物的癌细胞RR/RC的能力与二甲双胍对癌细胞的抑制作用相关性非常高,R2值分别为0.844和0.942。随后研究者测试了在异种移植小鼠中的二甲双胍抑制性与RR/RC的相关性。研究者选择了H1299和MiaPaCa2两种癌细胞系,这两种癌症在体外测试中相同的RR/RC能力对二甲双胍的抑制敏感性差异较大。在体内实验中发现,二甲双胍对源自MiaPaCa2的癌细胞的生长抑制比较明显,但对相同方法治疗的源自H1299的癌细胞抑制作用不明显,这与体外测量的结果相同。因此,这些研究表明,二甲双胍治疗癌症的功效可从开始治疗前的肿瘤组织RR/RC的评估中预测。

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图2:利用异种移植肿瘤样品技术,来研究体内癌细胞的呼吸特性和二甲双胍癌细胞生长抑制作用之间的相关性。A图表示异种移植癌细胞组织的呼吸测量方法和测量流程,以及对癌细胞的最大呼吸能力的测量。图B,异种移植癌细胞与体外相同癌细胞系的最大呼吸能力的相关性,二者相关性较高(R2=0.844);图C,异种移植癌细胞与体外相同癌细胞系的能量储备能力相关性较高(R2=0.942);图D和E,分别测量来自MiaPaCa2和H1299的异种移植癌细胞对于二甲双胍癌细胞抑制作用的敏感性,与对照组相比,二甲双胍对MiaPaCa2异种移植癌细胞的生长抑制作用较明显,而对H1299异种移植癌细胞的生长抑制作用几乎没有效果。这与体外实验的结果相一致

实验三、应用基因敲除技术和药理学技术降低癌细胞的RR/RC能力,二甲双胍的抑制癌细胞生长的能力显著增强

了解了癌细胞的RR/RC能力与二甲双胍的抑制性具有直接关联,那么即可通过降低癌细胞的RR/RC,使得二甲双胍的抑制能力得到提高。为此,研究者通过使用shRNA的低病毒滴度方法,实现了对基因敲除,降低了H1299癌细胞中复合物I蛋白NDUFAF7的表达,致使癌细胞的RR/RC的降低。将二甲双胍作用于基因敲除后的癌细胞,发现癌细胞的生长明显低于正常癌细胞。同理,使用基因敲除方法降低了复合物III蛋白UQCRFS1的表达,二甲双胍的抑制作用明显增强。

除了应用基因敲除技术,使电子传递链的蛋白复合物表达降低来导致癌细胞的RR/RC能力降低外,研究者还通过药理学方法降低了癌细胞的RR/RC能力。鱼藤酮可阻断氧化磷酸化过程中的电子传递,进而导致细胞的呼吸能力降低。经鱼藤酮处理的H1299癌细胞表现出对二甲双胍抑制作用更加敏感。总之,无论是基因敲除技术还是药理学方法,降低了癌细胞的RR/RC能力,二甲双胍对癌细胞生长的抑制作用将得到增强

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图3. 利用基因敲除技术,分别降低了电子传递链上两个蛋白复合物上的表达,A图可见不同剂量的基因敲除技术中,以sh-Scramble为对照组,随着sh-NDUFAF7的表达量减少,癌细胞的最大呼吸能力和能量储备能力均降低,加入二甲双胍后,图B可见癌细胞因sh-NDUFAF7的表达减少,引起RR/RC能力降低,导致癌细胞的生长能力下降;同理,基因敲除技术影响sh-UQCRFS1蛋白的表达(图C、图D),其结果与图A&B结果一致。图E、F为药物鱼藤酮减小细胞的RR/RC能力,随着鱼藤酮含量的增加,二甲双胍对细胞的生长抑制能力增强。

实验四、实验通过恶性转化将正常细胞转变为癌症细胞,发现癌症细胞的RR/RC能力变低,实验证明RR/RC能力越低,二甲双胍对癌细胞的生长抑制能力越强。

实验通过基因敲除肿瘤抑制因子p53和引入KRAS致癌突变体等方法,将正常人成纤维BJ细胞转化为癌细胞,通过实验可知癌细胞较正常良性细胞的RR/RC能力降低,实验证明RR/RC能力越低,二甲双胍对癌细胞的生长抑制能力越强。

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图4.本实验中,加入基因敲除肿瘤抑制因子p53和引入KRAS后,图A可见与对照组相比,p53的表达降低、KRAS的含量增加;图B中实验组与对照组相比,其最大呼吸能力与能量储备能力明显降低;图C加入二甲双胍后,观察癌细胞的生长情况,实验组的癌细胞生长情况明显少于对照组。

癌细胞在肿瘤发生过程中改变了其代谢程序。奥地利OROBOROS O2k细胞能量代谢测量与分析系统在肿瘤癌症等代谢性疾病领域的研究中,为研究癌细胞的生理特性,寻求治疗方案等提供理论依据。以上实验中的癌细胞的细胞呼吸实验,是利用OROBOROS O2k细胞能量代谢分析仪完成的。通过实验获得细胞最大呼吸能力(Max.resp.capacity RC)和能量储备能力(RR),为科研工作者在该实验中提供的必要的数据支持,并未临床靶向治疗提供了新的依据。

 

 




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