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【文献阅读】糖供应和糖饥饿过程中MYBS1和MYBS2相互调节αAMY的机制

已有 1098 次阅读 2020-4-27 10:45 |系统分类:科研笔记

文章题目:Sugar starvation-regulated MYBS2 and 14-3-3 protein interactions enhance plant growth, stress tolerance,and grain weight in rice

文章来源:PNAS

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本文亮点:

作者发现并揭示了一种独特的调控机制,αAMY表达的开/关开关是由两个竞争同一启动子元件的MYB转录因子调控的。在糖充足的情况下,MYBS2的72位点被磷酸化导致其从胞质进入核内抑制αAMY的表达,而在糖饥饿条件下,MYBS2S35位点的磷酸化使其与胞质中的GF14结合,减少其对MYBS1的竞争性,从而促进了MYBS与αAMY基因启动子的结合,加强了αAMY的表达。

主要结果部分:

MYBS2是种子萌发和植物生长的负调控因子,抑制αAMY表达

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通过在水稻中对MYBS2过量表达和来分敲低来分析其在植物生长中的生理功能→与SWT相比,2个Ox品系的发芽率降低、幼苗生长延迟、抽穗前的株高也较低,但敲低植株与SWT并无明显区别

MYBS2是否调控αAMY的表达?→将MYBS2Ox和Ri系的愈伤组织培养在无糖培养基(−S)中,然后转移到有糖培养基(+S)→αAMY3和αAMY8mRNA水平在WT中随时间的延长逐渐降低,在Ox中迅速降低,而在Ri中变化不明显,αAmy3的表达在Ox中被抑制而在Ri中被激活。

MYBS2与MYBS1竞争结合TA盒,并在糖饥饿条件下抑制αAMY启动子

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【目的】糖如何影响MYBS2抑制αAMY的表达?→【方法】利用水稻胚瞬时表达系统检测了MYBS1、MYBS2和MYBS2(Ri)分别对含有CaMV35SAmy3 SRC和TA盒启动子活性的影响→在−S培养基中,MYBS1增强了这两个启动子的活性,MYBS2Ri构建更显著地增强了这两个启动子的活性,但MYBS2抑制了这两个启动子的活性→MYBS2是一个转录抑制因子,它可以抵消MYBS1在糖饥饿条件下的转录反式激活活性。

MYBS1:MYBS2不同比例对TA启动子活性的影响→转染一定数量的MYBS2,但不断增加MYBS1的数量或者转染一定数量的MYBS1,不断增加MYBS2(Ri)的数量都会导致启动子活性显著增强。→【结果】MYBS1和MYBS2相互竞争结合TAbox。

MYBS2的核输入由糖供应促进

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【目的】MYBS2功能是否在亚细胞水平上受到调控?→【方法】在转基因水稻中表达了35S:MYBS2-GFP和35S:GFP→无论使用+S还是−S培养基,绿色荧光蛋白都定位于细胞核和细胞质中,然而在+S培养及NTOU基中的35S:MYBS2-GFP可以在根的细胞核中检测的到,但在-S中的35S:MYBS2-GFP可以在胞浆中检测到→大麦糊粉层瞬时表达系统进一步验证→【结果】当同一当提供糖时,MYBS2-GFP优先被输入到细胞核中。当细胞从+S转移到−S 时,MYBS2-GFP的定位从细胞核转移到细胞质

MYBS2是一种磷酸化蛋白

利用生物学信息分析发现MYBS2存在几个潜在的磷酸化位点【目的】MYB2是否能够被磷酸化→从转入CaMV35S:MYBS2-GFP的水稻胚性愈伤组织中提取总蛋白用GFP抗体和Phos-Tag(磷酸标签)进行免疫印迹分析→利用蛋白磷酸酶抑制剂处理进一步确定→【结果】MYBS2在+S和−S中都是可以被磷酸化的

【方法】IP+质谱检测MYBS2的磷酸化位点→【结果】Ser53和Ser75是MYBS2的两个磷酸化位点、

Ser75位的磷酸化促进MYBS2的糖依赖性核定位。

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MYBS2含有2个假定的核定位信号(NLSS),富含Arg(R)和Lys(K)氨基酸→【目的】NLSS是否在调节MYBS2的核质穿梭中起作用?→【方法】我们用Ala(A)取代Arg/Lys,构建了两个NLSS的突变结构,并分析了它们在大麦糊粉层中的活性→【结论】如图所示无论培养基中是否有糖,NLS1或NLS2的突变都会损害MYBS2的核输入,并且这两个NLSS的突变都完全阻止了MYBS2的核输入。

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之前有报道磷酸化在调节蛋白在核质运输中扮演很重要的角色→【目的方法】通过模拟磷酸化来观察Ser75是否影响MYBS2的核输入→【结果】如图所示Ser75位的磷酸化促进了MYBS2的核输入,可能与MYBS2在糖供应条件下的核定位有关。

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鉴定MYBS2功能结构域的过程中作者发现氨基酸1~53的缺失对6xTA启动子活性有较大的抑制作用,导致MYBS2GFP在+S和−S中仅有核定位→【猜想】N-末端结构域可能含有核输出信号(NES)或MYBS2定位在细胞质中所需的氨基酸序列→如图所示,作者分段突变,最终得出57~65位氨基酸是功能性NES

MYBS2与特异的14-3-3蛋白相互作用

CO-IP筛选MYBS2的互作蛋白→14-4-3( GF14)与其互作,并且糖饥饿激活几种GF14的表达

在有糖的情况下14-3-3蛋白通过限制MYBS2来取消对 αAmy3启动子的抑制

在糖饥饿条件下,MYBS2在Ser53位的磷酸化是与细胞质中的14-3-3蛋白相互作用所必需的。



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