应用于小鼠活体光学脑成像研究的显微外科技术简介

孙建军

        活体光学脑成像在现代神经科学研究中起着越来越重要的作用。由于活体研究是对正常生理状态下脑结构和功能的观察，因此具有离体研究所不可取代的优势。在现有的光学成像技术条件下，高质量的活体成像仍需要对研究区域脑组织的无创显露。由于小鼠饲养成本低又易于培育不同的转基因种系，目前活体光学脑成像研究对象主要是小鼠。小鼠头颅小，颅骨菲薄，大约150-200微米，与脑组织之间间隙狭小，这都给无创开颅造成了困难。在某些情况下，例如需要跨骨缝的大范围开颅、侧方开颅、硬脑膜去除或需要在脑裂隙里操作时，则会给术者带来更大的挑战。良好的显微外科技术是进行成功活体光学成像的基础。通过设计新的手术入路，应用显微外科技术显露解剖上较难暴露的脑区，通过活体光学成像技术把这些脑区的结构和功能揭示出来，则会为神经科学开辟新的研究领域。

        区别于传统的小鼠脑部立体定位手术，用于活体光学成像研究的手术在理念、器械和手术设置上完全不同，因此传统上的手术观念和技术需要做相应改变。

        手术理念：     小鼠的开颅和相关操作是显微外科手术，绝大部分的操作都需在手术显微镜下进行。因此，显微脑外科手术的基本理念均应该体现在手术的全过程中。这些理念包括：熟练掌握手术局部显微解剖；娴熟的显微外科技术，稳定和灵活的双手显微操作能力；大小适中的显微外科器械；充分的放大和照明；具有可以多角度操作的灵活的手术板设置；术者稳定的心态，耐心、毅力和灵活的术中应变能力等。

        手术设置    1，手术板和头部固定技术     传统的小鼠立体定位手术是在立体定位仪上进行，尽管它仍被用于小鼠开颅手术，但由于其体积大、相对笨重，影响了显微手术操作的灵活性。比如，在很多手术中，经常需要旋转手术板而达到一个最佳的操作角度。另外由于立体定位仪通常都有定位臂，它限制了手的活动，增加了手到术野的距离，使手术操作的稳定性下降。因此，用于光学成像和开颅手术的手术板要具有小型、轻巧、灵活、易于旋转和移动的特点。同时要有与手术板相匹配的保温毯。小鼠头部的固定多用耳棒的钝端， 只有在立体定位手术时应用耳棒的尖端。牙齿固定器要能够灵活旋转，以便在侧方开颅时协助头位的改变；2，显微镜和照明     一般应用体视显微镜，有一定的景深和立体感，最好可连续变倍。术中常用的放大倍数在4  -  10倍之间。使用可以灵活调节亮度和视角的冷光源作为照明；3，显微磨钻和其它手术器械     用于小鼠开颅手术的显微磨钻要有轻便、灵活，可多角度操作的特点。最好使用脚控变速的气动牙科钻，配有1/4 和1/2 的FG（friction grip）硬合金钻头。其它显微手术器械包括显微镊子、显微剪刀，应该小型、轻巧，用于硬膜切除的镊子和剪刀尖端应该保持锐利；用于脑组织吸除的显微吸引器头一般使用不同大小的针头作成，尖端最好磨成钝端以减少损伤，吸力要大小适中。另外要配备适合于小鼠手术的双极电凝器。

        手术技术   1，显微磨除技术       显微磨除是小鼠开颅手术最基本和最关键的技术，通过对颅骨的磨削，使骨瓣从周围颅骨和脑组织充分游离出来，使骨瓣“漂浮”于脑组织之上，从而使本来狭小的硬膜外间隙产生一个可伸入器械的操作空间，以利于骨瓣的移除。尽管小鼠颅骨菲薄，但与人的颅骨一样也分为外板、板障和内板三层，对其磨削应按解剖层次进行。避免由于钻透颅骨而造成脑组织损伤。整个磨除过程应该保持稳定性和耐心，并通过改变体位，获得最佳的操作角度。钻头的移动应该遵循稳、准、快、细的显微操作原则，尽量使用钻头的头端。在某些部位如冠状缝颅骨会明显增厚，因此磨除应该更加耐心；在涉及上矢状窦和横窦等静脉窦的开颅，应该尽可能的磨除覆盖于血管上的颅骨，使血管和颅骨的内面达到充分的分离，减少抬起颅骨时大出血的发生；颅骨应该以中线为界分两块移除，而不是整块切除，这样会显著减少出血的几率；2， 骨瓣移除技术，充分的磨削以使骨瓣与脑组织达到一定程度的分离，即骨瓣漂浮于脑组织之上是进行成功骨瓣移除的前提。通常，脑组织损伤和出血是由于在某些部位骨瓣并没有充分游离。在用镊尖抬起骨瓣并伸入硬膜外间隙的操作中，需要保持手的稳定并能灵活的转动角度，使镊子尽量靠近颅骨内面并与脑表面平行，以减少损伤的机会；3，硬膜剥离技术，小鼠硬膜菲薄，只有在显微镜下才能辨认。 硬膜切除的前提是硬膜和脑组织之间没有发生粘连，即存在一个潜在的硬膜下间隙。通常在颅骨磨削过程中应间断的用生理盐水或人工脑脊液冲洗，以避免硬膜和颅骨内面的粘连，这种粘连可以造成抬起颅骨时硬脑膜撕裂和靠近中线部位的桥静脉损伤。一旦颅骨去除以后，应尽量保持脑组织湿润，并尽快开始硬脑膜切除的操作，一旦脑组织暴露时间过长，硬脑膜和脑组织之间就可发生粘连，使硬膜的切除成为不可能。硬脑膜切除需要用细针尖挑起并撕破硬膜，从硬膜裂口出用两把显微镊子的镊尖抓持并抬起硬膜进行撕开。这个过程需要双手稳定细致的操作和良好的配合。通常，在接近中线部位，由于桥静脉和硬脑膜之间发生粘连，不能用镊尖进行撕除，这需要用显微剪刀沿静脉走形方向剪开硬膜并推向中线。由于操作接近桥静脉和上矢状窦，对手的稳定性要求非常高，轻微的晃动就可造成出血和损伤。4， 脑间隙内操作技术，小鼠大脑纵裂和横裂中有非常重要的脑皮层区，比如前额皮质、扣带皮质、压后皮质和内嗅皮质，对这些皮质的成像研究具有重要的意义。在目前的技术条件下，可以应用三棱镜技术和双光子显微镜技术， 把这些皮层成像出来。但由于小鼠脑裂隙狭小，在脑间隙中插入棱镜是一个很大的挑战。在脑纵裂中放入三棱镜需要充分暴露出纵裂池， 这就需要在开颅时中线部位不能被遗留有小骨片，中线部位如果有小骨片覆盖，会给三棱镜的插入带来很大的困难。因此，开颅时在中线部位的磨削就需要特别的耐心， 开颅后如果有遗留骨片，则需要用显微镊子细心的从上矢状窦上剥除。小骨瓣开颅后脑组织容易膨胀，会给硬膜切除造成很大困难。因此骨瓣的设计不能过小。 另外，通过术中枕大池造口而持续释放脑脊液可以有效的降低开颅后脑组织的膨胀，显著减少硬脑膜切除的难度。在充分暴露纵裂池的基础上，可以进行三棱镜地插入。操作时应尽可能一次完成，反复地操作会造成大量出血。插入过程两手的配合非常关键，通常一只手用镊子稳定的把三棱镜固定在正确的位置上，同时另一只手则需要清除积血并快速将三棱镜用生物胶固定。整个操作过程眼睛不要离开显微镜，因此最好有助手配合。5，脑组织内操作技术, 在目前技术条件下，由于双光子显微镜成像的深度有限，脑深部结构的成像仍然需要移除覆盖的脑组织。目前最常见的技术是通过吸除覆盖皮层暴露海马CA1进行海马成像研究。小鼠脑皮层的吸除应该使用有一定吸力的吸引器，配有不同大小的吸引器头。 吸引器头可用针头作成，头端最好磨成钝端，以减少损伤。吸除前应检查吸力的大小，吸力太小影响操作速度，太大可造成过度吸引。术中应根据需要选择不同大小的吸引器头。操作中熟悉局部解剖非常重要，以海马区暴露为例，应该熟悉皮层和胼胝体、胼胝体和海马的分界标志。皮层和胼胝体的辨认和解剖相对简单， 而胼胝体和海马之间边界的辨认和解剖则需要反复练习。尽管保留胼胝体也可以做到海马成像，但无创的胼胝体切除可以增加成像的深度和质量。6，颅底和侧方操作技术, 小鼠脑的许多功能区，如听觉皮质、第二感觉区、嗅旁皮质、内嗅皮质、岛叶皮质等位于侧方或居于颅底。 由于位于颅脑侧方而局部解剖复杂，手术暴露和适宜的成像系统设计均有一定难度。通常需要植入可以旋转的头板，并配有可侧方成像的照相机或可以旋转的显微镜。目前手术和成像系统还都在探索阶段。从手术角度来讲，由于解剖的限制，急性和慢性的暴露有很大差别。急性开颅可以通过广泛切除颞下肌肉、颞下颌关节和下颌骨而获得接近颅底的脑区的暴露，如内嗅皮质、梨状皮质等， 这些操作往往需要以牺牲横窦为代价，而一侧横窦阻断后是否或在多大程度上影响了脑的生理功能，还是一个需要探索的课题；对于慢性手术，由于不能损伤颞下颌关节，手术暴露主要是横窦上的区域，包括嗅旁皮质、听觉皮质等。侧方手术一般需要不同程度的旋转头部，并行有效的固定。对局部解剖的熟悉是关键。否则，由于这个区域富含血管和静脉窦，在切除肌肉和开颅时均可造成大出血。

          结语  小鼠活体脑成像是一个新兴的技术，它的发展只有数十年时间，从最初的大脑背侧面的小窗口成像逐渐向大范围、深部和中线结构以及颅底侧方脑成像发展。目前，显微镜技术、转基因动物技术和显微外科技术是活体光学成像技术的基石，而后者常常被忽略，成为活体脑成像的瓶颈。从事活体成像的研究人员应该进行基本的显微外科培训，复杂的操作应该依赖于专业人员来完成。由于显微外科技术在活体光学脑成像研究的重要性才刚刚被人们认识，它的发展仍有很大的空间，通过不断完善现有的技术并开发新的手术方式，扩展神经科学的研究领域和方式，对于活体光学脑成像研究具有非常重要的意义。